Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U.

Una composición inmunoestimulante, que comprende:

un oligómero de ARN aislado con una longitud de 5-40 nucleótidos que tiene una secuencia de bases que comprende al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U),

en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG; y

un lípido catiónico.

Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U

Campo de la invención La presente invención se refiere por lo general al campo de la inmunología y la estimulación inmune. De forma más particular, la presente invención se refiere a composiciones que contienen ácidos ribonucleicos inmunoestimulantes, homólogos de dichos ácidos ribonucleicos inmunoestimulantes, y procedimientos de tratamiento que usan dichas composiciones. Se cree que las composiciones y procedimientos de tratamiento de la invención son útiles para inducir la señalización a través del receptor 7 de tipo Toll (TLR7) y el receptor 8 de tipo Toll (TLR8) .

Antecedentes de la invención La respuesta inmune se divide conceptualmente en inmunidad innata e inmunidad adaptativa. Se cree que la inmunidad innata implica el reconocimiento de patrones moleculares asociados con agentes patógenos (PAMP) compartidos en común con ciertas clases de moléculas expresadas por microorganismos infecciosos o macromoléculas extrañas. Se cree que los PAMP se reconocen por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en ciertas células inmunes.

Los receptores de tipo toll (TLR) son una familia de polipéptidos altamente conservados que desempeñan un papel crítico en la inmunidad innata en mamíferos. En la actualidad, se han identificado diez miembros de la familia, denominados TLR1 -TLR10. Los dominios citoplasmáticos de los diversos TLR se caracterizan por un dominio receptor (TIR) de Toll-interleuquina 1 (IL-1) . Medzhitov R y col. (1998) Mol Cell 2: 253-8. El reconocimiento de la invasión microbiana por los TLR desencadena la activación de una cascada de señalización que esta conservada de forma evolutiva en Drosophila y mamíferos. Se ha informado que la proteína MyD88 adaptadora que contiene el dominio TIR se asocia con los TLR y recluta la quinasa asociada al receptor IL-1 (IRAK) y el factor 6 asociado a receptores (TRAF6) de factor de necrosis tumoral (TNF) a los TLR. Se cree que la ruta de señalización dependiente de MyD88 conduce a la activación de factores de transcripción de NF-KB y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) de quinasa c-Jun NH2 terminal (Jnk) , etapas críticas en la activación inmune y la producción de citoquinas inflamatorias. Para una revisión, véase Aderem A y col. (2000) Nature 406: 782-87.

Aunque se ha informado de un número específico de ligandos de TLR, aún quedan por identificar ligandos para algunos TLR. Los ligandos para TLR2 incluyen peptidoglicanos y lipopéptidos. Yoshimura A y col. (1999) J Immunol

163: 1-5; Yoshimura A y col. (1999) J Immunol 163: 1-5; Aliprantis AO y col. (1999) Science 285: 736-9. Se ha informado que el ARN bicatenario derivado de virus (ARNds) y poli I:C, un análogo sintético del ARNds, son ligandos de TLR3. Alexopoulou L y col. (2001) Nature 413: 732-8. El lipopolisacárido (LPS) es un ligando para TLR4. Poltorak A y col. (1998) Science 282: 2085-8; Hoshino K y col. (1999) J Immunol 162: 3749-52. La flagelina bacteriana es un ligando para TLR5. Hayashi F y col. (2001) Nature 410: 1099-1103. Se ha informado que el peptidoglicano es obligándonos solamente para TLR2 sino también para TLR6. Ozinsky A y col. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 13766-71; Takeuchi O y col. (2001) Int Immunol 13: 933-40. Se ha informado que el ADN bacteriano (ADN CpG) es un ligando de TLR9. Hemmi H y col. (2000) Nature 408: 740-5; Bauer S y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 9237-42. Todos los ligandos de TLR enumerados anteriormente incluyen ligamentos naturales, es decir, ligandos de TLR encontrados en la naturaleza como moléculas expresadas por microorganismos infecciosos. Los ligandos naturales para TLR1, TLR7, TLR8 y TLR10 no se conocen, aunque recientemente se informó que ciertos compuestos sintéticos de bajo peso molecular, las imidazoquinolonas imiquimod (R-837) y resiquimod (R848) , eran ligandos de TLR7. Hemmi H y col. (2002) Nat Immunol 3: 196-200.

Sumario de la invención La presente invención se basa en parte en el nuevo descubrimiento por los inventores de ciertos ARN inmunoestimulantes y moléculas de de tipo ARN (en lo sucesivo en el presente documento, simplemente "ARN") . Los inventores creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en las composiciones inmunoestimulantes de la invención requieren una secuencia de bases que incluya al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U) , en las que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG. La G puede ser una variante homólogo de G y/o el U puede ser independientemente una variante u homólogo de U. de forma sorprendente, las moléculas de ARN inmunoestimulante pueden ser monocatenarias o al menos parcialmente bicatenarias. También de forma sorprendente, las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención no requieren un motivo de CpG para ejercer su efecto inmunoestimulante. Sin que signifique que se queda ligado por ninguna teoría o mecanismo en particular, los inventores creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante señalizan a través de una ruta dependiente de MyD88, probablemente a través de un TLR. También sin que signifique que se queda ligado por ninguna teoría o mecanismo en particular, los inventores creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante interactúan con y señalizar a través de TLR8, TLR7, o algún otro TLR que aún está por identificar.

Los inventores también creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención son representativas de la clase de moléculas de ARN, encontradas en la naturaleza, que pueden inducir una respuesta inmune. Sin que signifique que se queda ligado a ninguna teoría o mecanismo en particular, los inventores creen que

la clase correspondiente de moléculas de ARN encontradas en la naturaleza está presente en el ARN ribosómico (ARNr) , ARN de transferencia (ARNt) , ARN mensajero (ARNm) , y ARN viral (ARNv) . A este respecto se debe observar que las moléculas de ARN inmunoestimulante de la presente invención tienen 5-40 nucleótidos de longitud. Tales moléculas de ARN cortas entran dentro del intervalo de los ARN mensajeros de longitud completa que se describe que son útiles en la transfección de células dendríticas para inducir una respuesta inmune a antígenos de cáncer. Véase, por ejemplo, Boczkowski D y col. (1996) J Exp Med 184: 465-72; Mitchell DA y col. (2000) Curr Opin Mol Ther 2: 176-81.

También se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en las composiciones y procedimientos de tratamiento de la invención se pueden combinar de forma ventajosa con ciertos agentes que estimulan la estabilización del ARN, formación de grupos locales de las moléculas de ARN, y/o tráfico de las moléculas de RNA en el compartimento endosómico de las células. En particular, se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que ciertos lípidos y/o liposomas son útiles a este respecto. Por ejemplo, parece que ciertos lípidos catiónicos, incluyendo en particular metil-sulfato de N-[1- (2, 3-dioleoiloxi) -propil]N, N, N-trimetilamonio (DOTAP) , son especialmente ventajosos cuando se combinan con las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención. Como otro ejemplo, la conjugación covalente de un resto de colesterilo con el ARN, por ejemplo en el extremo en la posición 3' del ARN, estimula el efecto inmunoestimulante del ARN, incluso en ausencia de lípido catiónico.

La invención proporciona composiciones de materia y procedimientos de tratamiento relacionados con las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención. Las composiciones y procedimientos son útiles, entre otros, para activar las células inmunes in vivo, in vitro, y ex vivo; para tratar infecciones; para tratar cáncer; para preparar una composición farmacéutica; para identificar un receptor diana paral ARN inmunoestimulante; y para identificar sistemáticamente y para caracterizar compuestos inmunoestimulantes adicionales. Además, las composiciones de material y procedimientos de tratamiento relacionados con las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la presente invención se pueden combinar de forma ventajosa con otras composiciones inmunoestimulantes de materia y procedimientos de tratamiento relacionados contables otras composiciones inmunoestimulantes de materia.

En un aspecto, la invención proporciona una composición inmunoestimulante que comprende un oligómero de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que tiene al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U) en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG, y un lípido catiónico. El oligómero de ARN puede ser de origen natural o natural. Un oligómero de ARN se puede derivar del ARN procariótico o se puede derivar... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunoestimulante, que comprende: un oligómero de ARN aislado con una longitud de 5-40 nucleótidos que tiene una secuencia de bases que comprende al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U) , en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG; y un lípido catiónico.

2. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que la secuencia de bases:

(a) comprend.

5. RURGY-3', en el que R representa purina, U representa uracilo, G representa guanina, e Y representa pirimidina;

(b) comprend.

5. GUAGU-3', en el que A representa adenina;

(c) comprend.

5. GUAGUGU-3';

(d) comprend.

5. GUUGB-3', en el que B representa U, G, o C, en el que C representa citosina;

(e) comprend.

5. GUGUG-3';

(f) comprend.

5. GUGUUUAC-3';

(g) comprend.

5. GUAGGCAC-3';

(h) comprend.

5. CUAGGCAC-3';

(i) comprend.

5. CUCGGCAC-3'; o

(j) es autocomplementaria en al menos un 50 por ciento.

3. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el oligómero:

(a) tiene una longitud de 5-12 nucleótidos;

(b) tiene una pluralidad de oligómeros, que comprende opcionalmente un oligómero que tiene una primera secuencia de bases y un oligómero que tiene una segunda secuencia de bases, en el que la primera secuencia de bases y la segunda secuencia de bases tienen una complementariedad de al menos un 50 por ciento, o un oligómero que tiene una secuencia de bases que comprend.

5. GUGUUUAC-3' y un oligómero que tiene una secuencia de bases que comprend.

5. GUAGGCAC-3';

(c) comprende una unión de la estructura principal no natural, opcionalmente un enlace de fosforotioato;

(d) comprende una base modificada seleccionada entre el grupo que consiste en 7-desazaguanina, 8-azaguanina, 5metiluracilo, y pseudouracilo; o

(e) un azúcar modificado.

4. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el lípido catiónico es metil-sulfato de N-[1- (2, 3dioleoiloxi) propil]-N, N, N-trimetilamonio (DOTAP) .

5. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un antígeno, opcionalmente en la que el antígeno es un alérgeno, un antígeno para el cáncer o un antígeno microbiano.

6. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que la secuencia de bases comprende al menos un 80 por ciento de guanina (G) y uracilo (U) .

8. La composición como se reivindica en la reivindicación 7, en la que la secuencia de bases comprende al menos un 90 por ciento guanina (G) y uracilo (U) .

9. La composición como se reivindica en la reivindicación 7, en la que dicho oligómero de ARN comprend.

5. GUUGB-3', en el que B representa U, G, o C.

10. La composición como se reivindica en la reivindicación 9, en la que dicho oligómero de ARN comprende múltiplos d.

5. GUUGB-3' unidos a través de un nucleósido de unión intermedio, que se selecciona entre el grupo que consiste en G y U.

11. La composición como se reivindica en la reivindicación 9 o 10, en la que B representa U.

12. La composición como se reivindica en la reivindicación 10 u 11, en la que el nucleósido de unión intermedio es

U.

13. Un procedimiento in vitro para activar una célula inmune, en el que dicha célula inmune se pone en contacto con la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en una cantidad eficaz para inducir la activación de la célula inmune.

14. Una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, para uso en un procedimiento de tratamiento mediante inducción de una respuesta inmune en un sujeto.

15. La composición como se reivindica en la reivindicación 14 para uso en el procedimiento de la reivindicación 14, en el que el sujeto tiene o está en riesgo de tener un cáncer, una infección con un agente seleccionado entre el grupo que consiste en virus, bacterias, hongos, y parásitos.

16. La composición como se reivindica en la reivindicación 14 para uso del procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo dicho procedimiento: administrar un antígeno a un sujeto; y administrar al sujeto dicha composición en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune al antígeno.

17. La composición como se reivindica en la reivindicación 14, para uso en el procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo dicho procedimiento:

aislar células dendríticas de un sujeto; poner en contacto las células dendríticas ex vivo con la composición; poner en contacto las células dendríticas ex vivo con un antígeno; y administrar al sujeto las células dendríticas puestas en contacto.

18. Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en un procedimiento de tratamiento por inducción de la señalización de TLR8.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 18 para uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende adicionalmente la cantidad eficaz de un ligando para un segundo TLR seleccionado entre el grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR9 y TLR10 para inducir la señalización por el segundo TLR.

20. La composición como se reivindica en la reivindicación 19, para uso en el procedimiento de la reivindicación 19 en la que el ligando para el TLR8 y el ligando para el segundo TLR están unidos.

21. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende: un conjugado de ADN:ARN, en el que el ADN del conjugado comprende un motivo de CpG eficaz para estimular la señalización de TLR9 y el ARN del conjugado comprende un oligómero de ARN aislado como se define la reivindicación 1, que es eficaz para estimular la señalización por TLR8.

22. La composición como se reivindica en la reivindicación 21, en la que el conjugado comprende una estructura principal de ADN:ARN quimérica, opcionalmente una estructura principal quimérica que comprende un sitio de escisión entre el ADN y el ARN o un heterodúplex de ADN:ARN bicatenario.

23. Una mezcla de nucleósidos que consiste básicamente en G o un derivado de guanosina seleccionado entre el grupo que consiste en: 8-bromoguanosina, 8-oxoguanosina, 8-mercaptoguanosina, 7-alil-8-oxoguanosina, complejo de ribonucleósido de guanosina y vanadilo, inosina, y nebularina, y U en una proporción entre 1 G:50 U y 10 G:1 U, para uso en un procedimiento de tratamiento por estimulación de la señalización de TLR8, en el que los nucleósidos son ribonucleósidos, o comprende una mezcla de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos.

24. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o una mezcla de acuerdo con la reivindicación 23 para uso en un procedimiento de tratamiento por estimulación de la señalización de TLR 8.

25. Un procedimiento para complementar una respuesta inmune mediada por TLR8 ex vivo, que comprende: poner en contacto TLR8 con una cantidad eficaz de una composición como se reivindica en la reivindicación 1 para inducir una respuesta inmune mediada por TLR8; y poner en contacto un TLR distinto de TLR8 con una cantidad eficaz de un ligando para el TLR distinto de TLR8 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR8.

26. Una composición como se reivindica en la reivindicación 1 para uso en un procedimiento de tratamiento mediante el complemento de una respuesta inmune mediada por TLR8 en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento:

administrar a un sujeto con necesidad de una respuesta inmune una cantidad eficaz de la composición para inducir una respuesta inmune mediada por TLR8; y administrar al sujeto una cantidad eficaz de un ligando para un TLR distinto de TLR8 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR8.

27. Una composición como se reivindica en la reivindicación 26 para uso en el procedimiento de la reivindicación 26, en la que el TLR distinto de TLR8 es TLR9.

28. Una composición como se reivindica en la reivindicación 26 para uso en el procedimiento de la reivindicación 26, en la que el ligando para TLR9 es un ácido nucleico CpG, opcionalmente con una estructura principal estabilizada.

29. Una composición como se reivindica en la reivindicación 19, en la que el oligómero de ARN aislado:

(a) es ARN bicatenario;

(b) es ARN ribosómico;

(c) es ARN de transferencia;

(d) es ARN mensajero;

(e) es ARN viral;

(f) tiene una composición de bases de al menos un 70 % de G, y opcionalmente forma parte de un heterodúplex de ADN:ARN, o consiste básicamente en el ribonucleósido de guanosina;

(g) tiene una composición de bases de al menos un 60 % de G y U; o

(h) consiste básicamente en G y U.