Oligorribonucleótidos inmunoestimuladores.

Un procedimiento para estimular la producción de una citocina proinflamatoria seleccionada entre TNF-alfa e IL-12 que comprende:

poner en contacto una célula que expresa TLR8 in vitro con un oligonucleótido de ARN (ORN) que comprende:

N-U-R1-R2, en el que N es un ribonucleótido y N no incluye un U, U es uracilo o un derivado del mismo, y R es un ribonucleótido en el que al menos uno de R1 y R2 es adenosina (A) o citosina (C) o derivados de los mismos y en el que R no es U a no ser que N-U-R1-R2 incluya al menos dos A, en el que el ORN es seleccionado de:

GCCACCGAGCCGAAUAUACC SEC ID Nº: 11;

AUAUAUAUAUAUAUAUAUAU SEC ID Nº: 12;

UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU SEC ID Nº: 13;

AAUAAUAAUAAUAAUAAUAA SEC ID Nº: 16;

AAAUAAAUAAAUAAAUAAAU SEC ID Nº: 17;

AAAAUAAAAUAAAAUAAAAU SEC ID Nº: 18;

CUACUACUACUACUACUACU SEC ID Nº: 24;

UUAUUAU SEC ID Nº: 30;

UAUAUAU SEC ID Nº: 33;

CCGAGCCGCAUAUCCC SEC ID Nº: 36;

CCGAGCCGCUAUACCC SEC ID Nº: 37;

CCGAGCCAUAUAUCCC SEC ID Nº: 38;

CCGAGCCAUAUAUAUC SEC ID Nº: 39;

CCGAGCCGAAUAACCC SEC ID Nº: 40;

CCGAGCCGCAUAACCC SEC ID Nº: 41;

CCGAGCCGAAUACCCC SEC ID Nº: 42;

CCGAGCCGCCUAACCC SEC ID Nº: 43;

CCGAGCCGAAUCCCCC SEC ID Nº: 44;

CCGAGCCGCAUACCCC SEC ID Nº: 45;

CCGAGCCGCAUCCCCC SEC ID Nº: 46;

CCGAGCCGCCUACCCC SEC ID Nº: 47;

CCGAGCCGCAUUACCC SEC ID Nº: 48;

CCGAGCCGCUAUCCCC SEC ID Nº: 55;

CCGAGCCGAAUGUACC SEC ID Nº: 63;

CCGAGCCGAUAUUACC SEC ID Nº: 65;

CCGAGCCGAAGGUACC SEC ID Nº: 82;

CCGAGCCGAAGGUGCC SEC ID Nº: 83;

CCGAGCCGAAGCUCCC SEC ID Nº: 84;

CCGAGCCGAAGAUACC SEC ID Nº: 85;

CCGAGCCGAAGCUACC SEC ID Nº: 87; y

CCGAGCCGAAGCUGCC SEC ID Nº: 88;

en el que el ORN incluye opcionalmente al menos una modificación en su estructura;

en una cantidad eficaz para estimular la producción de citocinas proinflamatorias y en el que la producción de IFN-α en respuesta al ORN no está inducida significativamente en relación al fondo; y además en el que el ORN está formando complejo con N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamoniometil-sulfato (DOTAP).

Oligorribonucleótidos ¡nmunoestimuladores Campo de ¡a invención

La invención se refiere, en general, al campo de la inmunología, y más particularmente a moléculas ¡nmunoestimuladores. Más específicamente, la invención se refiere a moléculas de ácido ribonucleico (ARN), Incluyendo oligorribonucleótidos, con actividad ¡nmunoestimuladores.

Antecedentes de ia invención

Los receptores tipo Toll (TLR) son una familia elevadamente conservada de péptldos receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y juegan un papel crítico en la Inmunidad Innata en mamíferos. Actualmente se han Identificado al menos diez miembros de la familia, denominados TLR1 - TLR10. Los dominios citoplásmicos de los diversos TLR están caracterizados por un dominio de receptor de Toll-lnterleuclna 1 (TIR). Medzhitov R y col., (1998) Mol Cell 2:253-8. El reconocimiento de la invasión microbiana mediante los TLR desencadena la activación de una cascada de señalización que está evolutivamente conservada en Drosophlla y mamíferos. Se ha comunicado que la proteína MyD88 adaptadora que contiene dominio TIR se asocia con los TLR y recluta la clnasa asociada a receptor de ¡nterleuclna 1 (IRAK) y al factor 6 asociado al receptor de factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAF6) a los TLR. Se cree que la vía de señalización dependiente de MyD88 conduce a la activación de factores de transcripción NF-nB y de la clnasa NH2 terminal c-Jun (Jnk) de las proteínas clnasas activadas por mltógeno (MAPK), etapas críticas en la activación Inmune y en la producción de cltoclnas Inflamatorias. Para revisiones, véase Aderem A y col., (2000) Nature 406:782-87, y Akira S y col., (2004) Nat Rev Immunol 4:499-511.

Se han Identificado una variedad de llgandos de TLR. Los llgandos para TLR2 incluyen peptidoglucanos y llpopéptldos. Yoshlmura A y col., (1999) J Immunol 163:1-5; Yoshlmura A y col., (1999) J Immunol 163:1-5; Aliprantis AO y col., (1999) Science 285:736-9. El llpopolisacárido (LPS) es un ligando para TLR4. Poltorak A y col., (1998) Science 282:2085-8; Hoshlno K y col., (1999) Jlmmunol 162:3749-52. La flagelina bacteriana es un ligando para TLR5. Hayashl F y col., (2001) Nature 410:1099-1103. Se ha comunicado que el peptidoglucano es un ligando no solo para TLR2 sino también para TLR6. Ozlnsky A y col., (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97:13766-71; Takeuchi O y col., (2001) Int Immunol 13:933-40. Se ha comunicado recientemente que determinados compuestos sintéticos de bajo peso molecular, las ¡midazoquinolinas imiquimod (R-837) y resiquimod (R-848), son ligandos de TLR7 y TLR8. Hemml H y col., (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M y col., (2002) Nat Immunol 3:499.

Comenzando con el descubrimiento reciente de que el ADN bacteriano no metilado y los análogos sintéticos del mismo (ADN CpG) son ligandos para TLR9 (Hemmi H y col., (2000) Nature 408:740-5; Bauer S y col., (2001) Proc Nati Acad Sel USA 98, 9237-42), se ha comunicado que los ligandos para determinados TLR incluyen determinadas moléculas de ácido nucleico. Se ha comunicado recientemente que determinados tipos de ARN son ¡nmunoestimuladores de modo independiente de secuencia o dependiente de secuencia. Además, se ha comunicado que estos varios ARN ¡nmunoestimuladores estimulan a TLR3, TLR7, o TLR8.

Sumarlo de la Invención

La descripción se refiere, en general, a oligorribonucleótidos ¡nmunoestimuladores (ORN) que contienen determinados motivos de ARN ¡nmunoestimuladores, así como a composiciones inmunoestimuladoras relacionadas que contienen dichos ORN ¡nmunoestimuladores, y procedimientos para el uso de dichos ORN ¡nmunoestimuladores y composiciones. Los ORN ¡nmunoestimuladores de la invención son útiles en cualquier configuración o aplicación que pretenda estimular o aumentar una respuesta inmune. Como se desvela más adelante, los ORN ¡nmunoestimuladores de la invención son de uso particular en la preparación de composiciones farmacéuticas, Incluyendo adyuvantes, vacunas, y otros medicamentos, para su uso en el tratamiento de una variedad de afecciones, Incluyendo Infección, cáncer, alergia, y asma. La invención en determinados aspectos se refiere por lo tanto al uso de composiciones inmunoestimuladoras que incluyen al ORN inmunoestimulador de la invención, así como procedimientos para su uso. También como se desvela más adelante, los ORN ¡nmunoestimuladores y composiciones Inmunoestimuladoras descritas en el presente documento son particularmente útiles en procedimientos para activar una célula inmunitaria o vacunar a un sujeto, o para tratar a un sujeto que tiene una deficiencia del sistema Inmune, para tratar a un sujeto que tiene una infección, para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad autolnmune, para tratar a un sujeto que tiene cáncer, para tratar a un sujeto que tiene una afección alérgica, para tratar a un sujeto que tiene asma, para el remodelado de las vías respiratorias, para promover la diseminación de epítopos, y para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

Como se desvela en mayor detalle más adelante, los ORN ¡nmunoestimuladores de la invención están caracterizados por su Inclusión de al menos un motivo de ARN inmunoestimulador dependiente de secuencia. El motivo de ARN Inmunoestimulador dependiente de secuencia es generalmente una secuencia corta de ARN, aunque en determinadas realizaciones el motivo también puede Incluir una modificación, tal como un enlace de fosfato ¡ntemucleótldo modificado, una nucleobase modificada, un azúcar modificado, un análogo de nucleótido, o cualquier combinación de los mismos. Como se describe detalladamente más adelante, en una realización, el motivo

de ARN ¡nmunoestimulador sucede en el contexto de un ORN inmunoestimulador más largo de la invención. También, el motivo de ARN ¡nmunoestimulador puede suceder en el contexto de una molécula de ácido nucleico de ADN:ARN quimérica.

Se desvela que los motivos de ARN inmunoestimuladores dependientes de secuencia y los ORN inmunoestimuladores que incorporan a dichos motivos son agonistas para TLR8. Más particularmente, se divulga que al menos algunos de los motivos de ARN inmunoestimuladores dependientes de secuencia, ORN inmunoestimuladores, y moléculas de ácido nucleico de ADN:ARN quimérico inmunoestimuladoras son agonistas de TLR8 pero no agonistas de TLR7.

El motivo de ARN ¡nmunoestimulador de acuerdo con algunos aspectos de la invención es N-U-R1-R2, en el que N es un ribonucleótido y N no incluye un U, U es uracilo o un derivado del mismo y

R es un ribonucleótido en el que al menos uno de R1 y R2 es adenosina (A) o citosina (C) o derivados de los mismos, y en el que R no es U a menos que N-U-R1-R2 incluya al menos dos A en el que el ORN de la invención se selecciona entre:

GCCACCGAGCCGAAUAUACC SEC ID N°: 11; AUAUAUAUAUAUAUAUAUAU SEC ID N°: 12; UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU SEC ID N°: 13; AAUAAUAAUAAUAAUAAUAASEC ID N°: 16; AAAUAAAUAAAUAAAUAAAU SEC ID N°: 17; AAAAUAAAAUAAAAUAAAAU SEC ID N°: 18; CUACUACUACUACUACUACU SEC ID N°: 24; UUAUUAU SEC ID N°: 30;

UAUAUAU SEC ID N°: 33; CCGAGCCGCAUAUCCC SEC ID N°: 36 CCGAGCCGCUAUACCC SEC ID N°: 37 CCGAGCCAUAUAUCCC SEC ID N°: 38 CCGAGCCAUAUAUAUC SEC ID N°: 39 CCGAGCCGAAUAACCC SEC ID N°: 40 CCGAGCCGCAUAACCC SEC ID N°: 41 CCGAGCCGAAUACCCC SEC ID N°: 42 CCGAGCCGCCUAACCC SEC ID N°: 43 CCGAGCCGAAUCCCCC SEC ID N°: 44 CCGAGCCGCAUACCCC SEC ID N°: 45 CCGAGCCGCAUCCCCC SEC ID N°: 46 CCGAGCCGCCUACCCC SEC ID N°: 47 CCGAGCCGCAUUACCC SEC ID N°: 48 CCGAGCCGCU AUCCCC SEC ID N°: 55;

CCGAGCCGAAUGUACC SEC ID N° CCGAGCCGAUAUUACC SEC ID N° CCGAGCCGAAGGUACC SECID N° CCGAGCCGAAGGUGCC SEC ID N° CCGAGCCGAAGCUCCC SECID N° CCGAGCCGAAGAUACC SEC ID N° CCGAGCCGAAGCUACC SEC ID N° CCGAGCCGAAGCUGCC SEC ID N°

en el que el ORN incluye opcionalmente al menos una modificación en su estructura.

En algunas realizaciones, N es adenosina o citosina (C) o derivados de los mismos. N-U-R1-R2 puede incluir en algunas realizaciones al menos 3 A o al menos 2 C. Opcionalmente, N-U-R1-R2 incluye al menos una G o C.

También se desvela en el presente documento un ORN donde el motivo ORN está separado de un ribonucleótido 5' o un ribonucleótido 3' o ambos mediante un enlazante no nucleotídico.

El ORN de la invención puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable que opcionalmente es un vehículo lipídico, tal como N-[1-(2,3-dioleo¡lox¡)prop¡l]-N,N,N-tr¡met¡lamon¡ometil-sulfato (DOTAP). En otras realizaciones, el ORN no forma complejo con DOTAP. El ORN de la invención puede comprender además engarces fosforotioato intemucleótido.

En otras realizaciones, el ORN incluye al menos un AU. En otras realizaciones más, el ORN incluye... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para estimular la producción de una citocina prolnflamatoria seleccionada entre TNF-alfa e IL-12 que comprende:

poner en contacto una célula que expresa TLR8 /n v/fro con un oligonucleótido de ARN (ORN) que comprende: N-U-R1-R2, en el que N es un ribonucleótldo y N no incluye un U, U es uracilo o un derivado del mismo, y R es un ribonucleótido en el que al menos uno de R1 y R2 es adenoslna (A) o citosina (C) o derivados de los mismos y en el que R no es U a no ser que N-U-R1-R2 Incluya al menos dos A, en el que el ORN es seleccionado de:

GCCACCGAGCCGAAUAUACC SEC ID N°: 11;

AUAUAUAUAUAUAUAUAUAU SEC ID N°: 12;

UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU SEC ID N°: 13;

AAUAAUAAUAAUAAUAAUAASEC ID N°: 16;

AAAUAAAUAAAUAAAUAAAU SEC ID N°: 17;

AAAAUAAAAUAAAAUAAAAU SEC ID N°: 18;

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CCGAGCCGCAUAUCCC SEC ID N°: 36;

CCGAGCCGCUAUACCC SEC ID N°: 37;

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CCGAGCCGAAUAACCC SEC ID N°: 40;

CCGAGCCGCAUAACCC SEC ID N°: 41;

CCGAGCCGAAUACCCC SEC ID N°: 42;

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CCGAGCCGAAUCCCCC SEC ID N°: 44;

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CCGAGCCGCCUACCCC SEC ID N°: 47;

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CCGAGCCGCUAUCCCC SEC ID N°: 55;

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CCGAGCCGAUAUUACC SEC ID N°: 65;

CCGAGCCGAAGGUACC SEC ID N°: 82;

CCGAGCCGAAGGUGCC SEC ID N°: 83;

CCGAGCCGAAGCUCCC SEC ID N°: 84;

CCGAGCCGAAGAUACC SEC ID N°: 85;

CCGAGCCGAAGCUACC SEC ID N°: 87; y

CCGAGCCGAAGCUGCC SEC ID N°: 88'

en el que el ORN incluye opcionalmente al menos una modificación en su estructura;

en una cantidad eficaz para estimular la producción de citocinas proinflamatorias y en el que la producción de IFN-a en respuesta al ORN no está inducida significativamente en relación al fondo; y además en el que el ORN está formando complejo con N-[1-(2,3-d¡oleo¡lox¡)propil]-N,N,N-tr¡met¡lamon¡omet¡l-sulfato (DOTAP).

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la producción de IFN-a en respuesta al ORN es menor de 300 pg/ml.

3. Un oligonucleótido de ARN (ORN) que comprende: N-U-R1-R2, en el que N es un ribonucleótido y N no incluye un U, U es uracilo o un derivado del mismo, y R es un ribonucleótido en el que al menos uno de R1 y R2 es adenosina (A) o citosina (C) o derivados de los mismos y en el que R no es U a menos que N-U-R1-R2 incluye al menos dos A, en el que el ORN se selecciona de:

GCCACCGAGCCGAAUAUACC SEC ID N°: 11;

AUAUAUAUAUAUAUAUAUAU SEC ID N°: 12;

UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU SEC ID N°: 13;

AAUAAUAAUAAUAAUAAUAASEC ID N°: 16;

AAAUAAAUAAAUAAAUAAAU SEC ID N°: 17;

AAAAUAAAAUAAAAUAAAAU SEC ID N°: 18;

CUACUACUACUACUACUACU SEC ID N°: 24;

UUAUUAU SEC ID N°: 30;

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CCGAGCCGCAUAUCCC SEC ID N°: 36;

CCGAGCCGCUAUACCC SEC ID N°: 37;

CCGAGCCAUAUAUCCC SEC ID N°: 38;

CCGAGCCAUAUAUAUC SEC ID N°: 39;

CCGAGCCGAAUAACCC SEC ID N°: 40;

CCGAGCCGCAUAACCC SEC ID N°: 41;

CCGAGCCGAAUACCCC SEC ID N°: 42;

CCGAGCCGCCUAACCC SEC ID N°: 43;

CCGAGCCGAAUCCCCC SEC ID N°: 44;

CCGAGCCGCAUACCCC SEC ID N°: 45;

CCGAGCCGCAUCCCCC SEC ID N°: 46;

CCGAGCCGCCUACCCC SEC ID N°: 47;

CCGAGCCGCAUUACCC SEC ID N°: 48;

CCGAGCCGCUAUCCCC SEC ID N°: 55;

CCGAGCCGAAUGUACC SEC ID N°: 63;

CCGAGCCGAUAUUACC SEC ID N°: 65;

CCGAGCCGAAGGUACC SEC ID N°: 82;

CCGAGCCGAAGGUGCC SEC ID N°: 83; CCGAGCCGAAGCUCCC SEC ID N°: 84; CCGAGCCGAAGAUACC SEC ID N°: 85;

CCGAGCCGAAGCUACC SEC ID N°: 87; y CCGAGCCGAAGCUGCC SEC ID N°: 88;

en el que el ORN Incluye opclonalmente al menos una modificación en su estructura.

4. El ORN de la reivindicación 3, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5 5. El ORN de la reivindicación 3, en el que el ORN está formando complejo con N-[1-(2,3-dioleoilox¡)prop¡l]-N,N,N-

trlmetllamonlometll-sulfato (DOTAP).

6. El ollgonucleótldo de ARN (ORN) de la reivindicación 3, en el que el oligonucleótido comprende además enlaces de fosforotloato ¡nternucleótldo.

7. Un uso de una composición de un ORN de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en la fabricación de un 10 medicamento para el tratamiento de una deficiencia del sistema inmune, una infección, una enfermedad autoinmune,

cáncer, una afección alérgica, asma, asma exacerbada por una infección viral, o para su uso en el tratamiento de la remodelación de las vías respiratorias.

8. El ORN de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, para su uso en el tratamiento de una deficiencia del sistema Inmune, una Infección, una enfermedad autoinmune, cáncer, una afección alérgica, asma, asma exacerbada por una

15 Infección viral, o para su uso en el tratamiento de la remodelación de las vías respiratorias.

9. Un procedimiento para regular negativamente células reguladoras (Treg) CD4+ inmunosupresoras, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto /n v/íro una célula Treg CD4+ con una composición que comprende un ORN de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6 en una cantidad eficaz para reducir el efecto inhibidor de la célula Treg CD4+.

20 10. El ORN de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, para su uso como un medicamento.

11. El ORN de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6 y de la reivindicación 10, para su uso en la estimulación o modulación de una respuesta Inmune.