Nuevos sustratos con fluorescencia reprimida, su preparación y su uso para la identificación, la detección y el análisis de Legionella pneumophila.

Péptido sustrato selectivo de la Major Secreted Protein (Msp) de Legionella pneumophila,

con fórmula (I):

(I) R-(X)n-Fluo-Rep-(Gly)m-Z-NH2

en la que,

· Fluo es un aminoácido-a de configuración (L), que posee en su cadena lateral un grupo fluorigénico seleccionado de entre el grupo constituido por la (L)-(1-pirenil)-alanina, la (L)-Nε(retroAbz)-Lis, la (L)-(7- metoxicumarin-4-il)-alanina, la (L)-((6,7-dimetoxi-cumarin-4-il)-alanina, la (L)-Nβ(pirenilacetil)-Dap, la (L)- Nγ(pirenilacetil))-Dab, la (L)-Nδ-(pirenilacetil)-Orn, la (L)-Nε-(pirenilacetil)-Lis, la (L)-S-(1-pirenometil)-Cis y la (L)-O-(1-pirenometil)-Ser,

· Rep es un aminoácido de configuración (L) seleccionado de entre la (3-NO2)Tyr y la (4-NO2)Phe, entendiéndose que cuando Fluo es la pirenilalanina, Rep es la (3-NO2)Tyr,

· R es un grupo seleccionado de entre los grupos acetilo, succinilo y metoxisuccinilo,

· X es un aminoácido-a de configuración (L) seleccionado de entre el grupo constituido por: Gly, Ser, homo- Ser, Lys, homo-Lys, Arg, homo-Arg y Orn,

· Z es un aminoácido-a cargado positivamente, y

· n y m son dos números enteros naturales, estando n comprendido entre 0 y 3 y estando m comprendido entre 0 y 2.

Nuevos sustratos con fluorescencia reprimida, su preparación y su uso para la identificación, la detección y el análisis de Legionella pneumophila.

La presente invención tiene por objeto un nuevo procedimiento de detección y de análisis de las legionelas de la especie Legionella pneumophila en todos los medios potencialmente contaminados por esta bacteria.

Las legionelas son unas bacterias acuáticas que se encuentran en las aguas naturales (lagos, ríos y pantanos) y que se desarrollan particularmente en las aguas templadas (entre 25 y 45°C). Estas bacterias son responsables en el hombre de infecciones respiratorias agudas, las legionelosis (enfermedad del legionario, fiebre de Pontiac) así como de anomalías biológicas extrapulmonares no específicas. A día de hoy, se han identificado aproximadamente 50 especies de Legionella. La especie L. pneumophila es la más extendida y la más virulenta para el hombre. Entre los 16 serogrupos de L. pneumophila (que representan del 90 al 95% de los casos clínicos), el serogrupo (SG) 1 es responsable del 84% de las infecciones humanas. La infección aparece después de la inhalación de aerosoles cargados en legionelas, que alcanzan los alvéolos pulmonares. Las bacterias se desarrollan entonces en los macrófagos alveolares y después en el tejido pulmonar. Las personas afectadas por esta enfermedad son en general personas mayores y/o que sufren de deficiencias inmunitarias graves.

La enfermedad del legionario se considera como una infección oportunista. En Francia, los datos procedentes de la declaración obligatoria informan de 1527 casos de legionelosis declarados en 2005, lo que representa una incidencia de 2 casos por 100000 habitantes contra una estimación de 8000 a 18000 casos de legionelosis cada año en los Estados Unidos.

Las legionelas colonizan naturalmente las redes de abastecimiento de agua. Están presentes en las aguas recalentadas de los sistemas de aire acondicionado, de las torres aerorrefrigerantes (TAR), en las redes de agua caliente sanitaria (calentadores de agua eléctricos) en las que se multiplican de manera óptima entre 30°C y 40°C. Pueden contaminar instalaciones como las piscinas, los equipamientos de estaciones termales, las fuentes y, en los hospitales, los humidificadores, los respiradores o los nebulizadores. En realidad, las legionelas se encuentran generalmente, en muy alta cantidad, en las biopelículas (Declerck et al., Curr. Microbio!., 2007, 55, 5, 435-440) asociadas a unos protozoarios (amebas), que, ingiriéndolos, permiten su crecimiento intracelular y su replicación. La detección de las legionelas está sometida a una reglamentación en las instalaciones de riesgo. Las normas actuales para la investigaciones y el recuento de las legionelas están basadas en el uso de técnicas de cultivo (norma internacional ISO 11731 y norma francesa AFNOR NF R90-431). Estas técnicas son muy sensibles, pero largas de realizar (de 10 a 15 días), delicadas ya que las legionelas tienen un porcentaje de crecimiento bajo y necesitan un personal cualificado para el establecimiento del diagnóstico.

Se han desarrollado unos enfoques alternativos durante estos últimos años:

1 - La técnica de PCR en tiempo real (RT-PCR). Desde 2006, una norma experimental (XP T 90-47) encuadra

este método que es rápido, sensible y específico. Sin embargo, no existe ninguna correlación estricta entre UFC y Unidad Genoma (UG) accesible por PCR, lo que plantea un problema. Por otro lado, esta técnica necesita un equipamiento de laboratorio particular, un personal cualificado y presenta un coste elevado.

2 - Las técnicas de detección por inmunocromatografía o inmunofluorescencia. Estos enfoques inmunológicos

son metodológicamente más simples, pero necesitan unos anticuerpos de amplia especificidad frente a las especies buscadas y su sensibilidad varía mucho en función del método de detección utilizado. Estos enfoques requieren también un equipamiento y un personal adecuados y el precio de fabricación es elevado. Actualmente, estas técnicas no se utilizan rutinariamente.

3 - El método de hibridación in situ con detección fluorimétrica (FISH). Este método reciente (Declerck y Ollevier,

Methods Mol. Biol., 2006, 345, 175-183) es sensible y rápido, pero necesita, como los anteriores, un material específico de un coste elevado y un personal cualificado, lo que hace esta técnica marginal.

4 - La ATPmetría. Este método permite detectar la concentración de bacterias metabólicamente activas y

representa un medio de alerta eficaz. Unos kits de ATPmetría están disponibles a bajo coste, pero no son específicos de las legionelas.

Ninguno de estos métodos es al mismo tiempo específico, sensible, rápido, utilizable sobre el terreno y de un precio de fabricación razonable.

Existe por lo tanto todavía una necesidad de un nuevo método de detección y de análisis de las legionelas que presentan todas las cualidades anteriormente definidas.

Los presentes inventores proponen tal método basándose en la medición de la actividad de una proteasa específica segregada por la bacteria.

A partir de 1979, se ha puesto en evidencia una proteasa segregada por diferentes cepas de L. pneumophila (Baine ef al., Journal of Clinical Microbiology, 1979, 9, 3, 453-456). Presenta una actividad proteolítica sobre diferentes proteínas del suero (Müller, Infect. Immun., 1980, 27, 51-53) así como sobre el colágeno, la caseína y la gelatina (Thompson ef al., Infect. Immun., 1981, 34, 299-302). Es la proteína más abundante encontrada en los sobrenadantes de cultivo de L. pneumophila, de ahí su nombre Major Secretory Protein, Msp.

Finalmente, la Msp forma parte de numerosos factores de virulencia caracterizados en la familia Legionella'. presenta unas acciones citotóxicas y hemolíticas (Dowling ef al., Microbiological Reviews, 1992, 56, 1, 32-60), en particular en la cobaya, provocando hemorragias y lesiones necróticas (Conlan ef al., J. Gen. Microbio/., 1986, 132, 1565-1574, Rosenfeld ef al., FEMS Microbio!. Lett., 1986, 37, 51-58). Es interesante señalar que estas propiedades citotóxicas y hemolíticas están directamente relacionadas con la actividad proteásica de la Msp. En efecto, la mutación del residuo Glu378 implicado en el acto catalítico, conduce a una proteasa inactiva y no citotóxica (Moffat ef al., Mol. Microbio!., 1994, 12, 693-705).

Un sustrato cromogénico, MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), primitivamente desarrollado para la caracterización de la a-quimotripsina (Berdal ef al., European Journal of Clinical Microbiology, 1982, 1, 1, 7-11), se ha utilizado para detectar la Msp en diferentes cepas de legionelas (Mclntyre ef al., Acta Pathol. Microbio!. Immunol. Scand., 1991, 99, 4, 316-320), a pesar de la falta de selectividad de dicho sustrato. En 283 cepas ensayadas de Legionella pneumophila, 282 han degradado el sustrato. En 6 otras especies de legionelas, sólo 2 han respondido positivamente, así como algunas especies de Pseudomonas aeruginosa (22 sobre 40). Estos resultados preliminares muestran por lo tanto una relativa especificidad de la Msp de L. pneumophila con respecto a otros patógenos para el sustrato S-2586 que sigue siendo no obstante poco sensible y no suficientemente selectivo.

Teniendo en cuenta las importantes propiedades de la Msp, es decir la abundancia de su liberación en el medio acuoso, su relación con la patogenicidad de la bacteria y su especificidad frente a proteínas segregadas por otros patógenos, los presentes inventores han utilizado la Msp como marcador de la presencia de Legionella pneumophila en diferentes redes de agua. Con este objetivo, se ha desarrollado un método de detección y de cuantificación específica, sensible y rápida de esta proteasa. Se ha establecido una correlación estadísticamente significativa entre la cantidad de Msp analizada y la cantidad de Legionella pneumophila presente en la muestra de agua analizada.

La Msp se purificó primitivamente a partir de sobrenadantes de cultivo de Legionella pneumophila (Dreyfus y Iglewskl, Infect. Immun., 1986, 51, 736-743): es una metalopeptidasa de zinc de 38 kDa, en su forma madura, de punto Isoeléctrico 4,20 y cuyo pH óptimo de funcionamiento está comprendido entre 5,5 y 7,5. El número de acceso de la Msp de Legionella pneumophila es P21347 en Swissprot/UniProtKB. La secuencia completa de la Msp de Legionella pneumophila está compuesta de 543 aminoácidos repartidos de la siguiente manera (residuos 1-24: péptido señal, residuos 25-207: secuencia "propéptido", residuos 208-543: metaloproteasa de zinc).

Presenta importantes homologías de secuencias con la pseudollslna (Pseudomonas aeruginosa elastase, Black ef al., J. Bacterio/., 1990, 172, 2608-2613)... [Seguir leyendo]

1. Péptido sustrato selectivo de la Major Secreted Protein (Msp) de Legionella pneumophila, con fórmula (I):

(I) R-(X)n-Fluo-Rep-(Gly)m-Z-NH2

en la que,

Fluo es un aminoácido-a de configuración (L), que posee en su cadena lateral un grupo fluorigénico seleccionado de entre el grupo constituido por la (L)-(1-pirenil)-alan¡na, la (L)-Ne(retroAbz)-Lls, la (L)-(7- metox¡cumarin-4-¡l)-alan¡na, la (L)-((6,7-d¡metox¡-cumarin-4-¡l)-alan¡na, la (L)-Np(piren¡lacetil)-Dap, la (L)- NY(pirenilacetil))-Dab, la (L)-Nó-(p¡ren¡lacetil)-Orn, la (L)-Ne-(pirenilacetil)-Lis, la (L)-S-(1-plrenometll)-C¡s y la (L)-0-(1-pirenometll)-Ser,

Rep es un aminoácido de configuración (L) seleccionado de entre la (3-N02)Tyr y la (4-N02)Phe, entendiéndose que cuando Fluo es la plrenllalanina, Rep es la (3-N02)Tyr,

R es un grupo seleccionado de entre los grupos acetilo, succlnllo y metoxisuccinilo,

X es un aminoácido-a de configuración (L) seleccionado de entre el grupo constituido por: Gly, Ser, homo- Ser, Lys, homo-Lys, Arg, homo-Arg y Orn,

Z es un aminoácido-a cargado positivamente, y

n y m son dos números enteros naturales, estando n comprendido entre 0 y 3 y estando m comprendido entre 0 y 2.

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el resto Fluo es la (L)-( 1 -pirenil)-alanina.

3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el resto Rep es la (3-N02)Tyr.

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que Z se selecciona de entre el grupo constituido por (L)-Lys, (L)-/7omo-Lys, (L)-Orn, (L)-Arg y (L)-/7omo-Arg.

5. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho péptido se selecciona de entre el grupo constituido por:

Compuesto 1- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Gly-Lys-NH2 Compuesto 2- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Lys-NH2 Compuesto 3- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-NC>2)Tyr-Lys-NH2 Compuesto 4- Ac-Ser-Arg-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Gly-Lys-NH2 Compuesto 5- Ac-Arg-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Gly-Lys-NH2 Compuesto 6- Ac-Ser-homo-Arg-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Gly-Lys-NH2 Compuesto 7- Ac-Ser-Orn-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Gly-Lys-NH2 Compuesto 8- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Orn-NH2 Compuesto 9- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-homo-Lys-NH2 Compuesto 10- Ac-homo-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Orn-NH2 Compuesto 11- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Arg-NH2 Compuesto 12- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-homo-Arg-NH2, y Compuesto 13- Ac-Ser-Lys-Gly-(£-Abz)Lys-(3-N02)Tyr-0rn-NH2.

6. Péptido según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho péptido se selecciona de entre el grupo constituido por:

Compuesto 1- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-Gly-Gly-Lys-NH2 Compuesto 8-Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-0rn-NH2, y Compuesto 12- Ac-Ser-Lys-Gly-Pya-(3-N02)Tyr-homoArg-NH2.

7. Procedimiento de detección de la actividad proteasa de la Major Secreted Protein (Msp) de Legionella pneumophila en una muestra de una solución, que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicha muestra con un compuesto de la fórmula (I) según una de las reivindicaciones 1 a 6,

y

b) detectar una emisión de fluorescencia.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que la etapa a) se realiza a una temperatura comprendida entre 20°C y 55°C, preferentemente entre 25°C y 45°C, más preferentemente entre 30°C y 40°C, todavía más preferentemente entre 35°C y 38°C.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por que la temperatura es igual a 37°C.

10. Procedimiento de análisis de la Major Secreteó Protein (MSp) de Legionella pneumophila en una muestra de una solución, que comprende las etapas siguientes:

a) detectar la actividad proteasa de la Msp según el procedimiento de las reivindicaciones 7 a 9,

b) medir la emisión de fluorescencia, y

c) deducir del valor de la emisión de fluorescencia la cantidad de Msp presente en la muestra.

11. Procedimiento de análisis de la Msp según la reivindicación 10, caracterizado por que comprende una etapa suplementaria de concentración de la enzima antes de la etapa a).

12. Procedimiento de análisis de la Msp según la reivindicación 11, caracterizado por que la concentración de la muestra se realiza antes de la etapa a).

13. Procedimiento de análisis de Legionella pneumophila en una muestra de una solución, que comprende las etapas siguientes:

a) analizar la Msp en dicha muestra según el procedimiento de las reivindicaciones 10 a 12, y

b) deducir de la misma la cantidad de Legionella pneumophila.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado por que la solución es un medio susceptible de contener unas bacterias de tipo Legionella pneumophila.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por que dicha solución es un agua caliente sanitaria o un agua de torre aerorrefrigerante.

16. Kit para la detección y el análisis de Legionella pneumophila, conteniendo dicho kit por lo menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.