Nuevos fármacos para inhibición de la expresión genética.

Un proceso para la preparación de un conjugado que consiste en un oligonucleótido conjugado con una molécula de esfingosina,

comprendiendo el proceso la conjugación de un oligonucleótido con una esfingosina.

Nuevos fármacos para inhibición de la expresión genética Campo de la invención

La invención se refiere a nuevos análogos oligoméricos y su uso en terapias basadas en oligonucleótidos. Más específicamente, la invención se refiere a oligonucleótidos que tienen moléculas lipídicas y su uso como inhibidores potenciales de la expresión genética.

Antecedentes de la invención

El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo regulador de origen natural de la mayoría de células eucariotas que utiliza moléculas pequeñas de ARN de doble cadena (dsARN) para dirigir un silenciamiento genético dependiente de la homología. Su descubrimiento por Fire y Mello en el gusano C. elegans {Fire, 1998} fue premiado con el premio Nobel en 26. Poco después de su primera descripción, se demostró que el ARNi también se encontraba en células de mamífero, no por medio de dsARN sino por medio de ARN de interferencia pequeño de doble cadena (ARNpi) de 21 nucleótidos de largo {Elbashir, 21}.

Se cree que el proceso del ARN de interferencia es un mecanismo de defensa celular conservado a lo largo de la evolución que se utiliza para evitar la expresión de genes ajenos y se comparte comúnmente por una flora diversa, donde se llama silenciamiento genético post-transcripcional, y fila. Desde el descubrimiento del mecanismo ARNi ha habido una explosión de investigación para descubrir nuevos compuestos que puedan alterar selectivamente la expresión genética como una nueva forma para tratar la enfermedad humana dirigiéndose a dianas que por otra parte son "intratables" con las estrategias farmacéuticas tradicionales que implican moléculas o proteínas.

De acuerdo con los conocimientos actuales, el mecanismo del ARNi se inicia cuando los ARN de cadena doble larga se procesan por una proteína tipo RNasa III conocida como Dicer. La proteína Dicer contiene normalmente un dominio ARN helicasa en el extremo N, un dominio de unión al ARN denominado Piwi/Argonauta/Zwille (PAZ), dos dominios RNasa III y un dominio de unión a ARN bicatenario (dsRBD) {Collins, 25} y su actividad da lugar al procesamiento de los ARN de doble cadena largos en ARNpi de doble cadena de 21-24 nucleótidos con dos bases protuberantes 3 y un fosfato 5 y grupo hidroxilo 3. Los dúplex ARNpi resultantes se incorporan entonces en un complejo efector conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), en donde la cadena antisentido o guía del ARNpi guía al RISC para que reconozca y escinda secuencias de ARNm diana {Elbashir, 21} por desenrollamiento dependiente de (ATP) de la molécula de ARNpi de doble cadena por medio de una actividad ARN helicasa {Nykanen, 21}. La actividad catalítica del RISC, que da lugar a la degradación del ARNm, está mediada por la endonucleasa Argonauta 2 (AG2) {Liu, 24; Song, 24}. La AG2 pertenece a la familia de proteínas Argonautas altamente conservadas. Las proteínas Argonautas son proteínas altamente básicas de ~ 1 kDa que contienen dos dominios comunes, a saber PIWI y PAZ {Cerutti, 2}. El dominio PIWI es crucial para la interacción con Dicer y contiene la actividad nucleasa responsable de la escisión de los ARNm {Song, 24}. La AG2 utiliza una cadena del dúplex ARNpi como guía para encontrar los ARN mensajeros que contienen secuencias complementarias y escinde la estructura fosfodiéster entre las bases 1 y 11 con respecto al extremo 5 de la cadena guía {Elbashir, 21}. Una etapa importante durante la activación de RISC es la escisión de la cadena en sentido o pasajera por AG2, eliminando esta cadena del complejo {Rand, 25}. Estudios de cristalografía que analizaron la interacción entre la cadena guía de ARNpi y el dominio PIWI revelaron que solo los nucleótidos 2 a 8 que constituyen una "secuencia semilla" que dirige el reconocimiento del ARNm diana del RISC {Ma, 25}. Una vez que se ha escindido el ARNm, y debido a la presencia de extremos de ARN sin protección en los fragmentos, el ARNm se escinde y degrada más por medio de las nucleasas intracelulares y no se volverá a traducir en proteínas {Orban, 25} mientras que el RISC se reciclará para rondas posteriores {Hutvagner, 22}. Esto constituye un proceso catalítico que da lugar a una reducción selectiva de moléculas ARNm específicas y las correspondientes proteínas. Es posible explotar este mecanismo nativo para el silenciamiento genético con el fin de regular cualquier gen(es) de elección suministrando directamente ARNpi efectores en las células o tejidos, donde activarán el RISC y producirá un silenciamiento potente y específico del ARNm al que se dirige.

Se han publicado muchos estudios que describen las características ideales que debería tener un ARNpi para conseguir la máxima eficacia, con respecto a su longitud, estructura, composición química, y secuencia. Los parámetros iniciales para el diseño de ARNpi se expusieron por Tuschl y sus colegas en el documento WO 2/44321, aunque muchos estudios y/o mejoras posteriores se han publicado desde entonces.

También se han hecho muchos esfuerzos en aumentar la estabilidad del ARNpi ya que esto se percibe como uno de los principales obstáculos para la terapia basada en ARNpi, dada la naturaleza ubicua de las ARNasas. Una de las estrategias principales que se han seguido para el aumento de estabilidad ha sido el uso de nucleótidos modificados tales como los nucleótidos 2--metil, 2 amino nucleótidos, nucleótidos que contienen puentes metileno 2- o 4-C. También se ha descrito la modificación de la estructura de ribonucleótidos que conecta nucleótidos adyacentes, principalmente por la introducción de nucleótidos modificados con fosforotioato. Parece ser que el aumento de estabilidad a menudo es inversamente proporcional a la eficacia (Parish, 2), y solo un cierto número, posiciones

y/o combinaciones de nucleótidos modificados puede dar como resultado un compuesto de silenciamiento estable. Como sesto es un obstáculo importante en los tratamientos basados en ARNpi, se han publicado diferentes estudios que describen ciertos patrones de modificación que muestras buenos resultados, ejemplos de tales son por ejemplo, los documentos EP1527176, W28/5329, W28/14978 o W29/44392, aunque se encuentran muchos más en la bibliografía.

Otra estrategia para conseguir el suministro eficaz de ARNpi a las células diana es el uso de lípidos, que pueden envolver el compuesto de ARNpi, que lo hace inaccesible a las nucleasas. Como tales, se han descrito estrategias que se basan en el empaquetamiento de ARNpi en liposomas. Soluciones más sofisticadas en esta línea son las partículas pequeñas lipídicas de ácido nucleico o SNALP, que se describen por ejemplo en las solicitudes de patente US26134189, US262493 o US27135372. Los lípidos que se utilizan pueden ser lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos conjugados, incluso se han utilizado lípidos que contienen cadenas polialquilamina como agentes de captura de moléculas (documento WO 24/11499). Otra alternativa son las formulaciones lipoplex descritas en el documento WO 27/121947, que se basa en un liposoma que contiene un lípido auxiliar y un compuesto protector que se une al ácido nucleico, en el que dicho complejo ácido nucleico-compuesto protector se libera de la composición lipídica bajo condiciones in vivo. En una realización específica la formulación lipoplex comprende un ARNpi y un compuesto protector que es un conjugado de PEG y ceramida.

Se ha demostrado que la conjugación de moléculas lipídicas con oligonucleótidos tales como colesterol (Boutorine, 1993; Gryaznov, 1993; Zelphati, 1994) produce conjugados de oligonucleótidos que tienen propiedades inhibidoras mejoradas ((Godard,. 1995; Le Doan, 1999; Soutscheck, 24; Wolfrum, 27). La captación eficaz y selectiva de estos conjugados de ARNpi depende de las interacciones con las partículas lipoproteicas, los receptores de lipoproteína y las proteínas transmembrana. La lipoproteína de alta densidad dirige el suministro de ARNpi al hígado. Como tales conjugados lipidíeos diferentes probablemente aumentarán el suministro a diferentes órganos, permitirán de esta manera el tratamiento de diferentes enfermedades.

El documento WO 29/925 desvela micelas mezcladas de ARNpi unidas a un resto hidrófobo. Se has sugeridos varias posibilidades como restos hidrófobos para la conjugación, incluyendo el colesterol.

El documento WO 28/1915 desvela la encapsulación de ARNpi en liposomas catiónicos utilizando restos lipófilos tales como la fosfocolina. Se describen conjugados de oligonucleótidos formados con restos de unión tal como PEG, pero esta publicación no desvela la conjugación con restos lipófilos.

El documento WO 28/14979 desvela ácidos nucleicos modificados por un lípido, que se pretende que actúe como un agente inmunoestimulante... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la preparación de un conjugado que consiste en un oligonucleótido conjugado con una molécula de esfingosina, comprendiendo el proceso la conjugación de un oligonucleótido con una esfingosina.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la esfingosina se conjuga con un oligonucleótido por enlaces fosfato o amida.

3. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende las etapas de:

unir un grupo amino o carboxilo en al menos un extremo de un oligonucleótido;

activar dicho grupo amino o carboxilo; y permitir que un grupo amino en una esfingosina se una al grupo activado del oligonucleótido, tal que el grupo activado se desplace y se forme un conjugado oligonucleótido-esfingosina.

4. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha esfingosina se proporciona en un soporte sólido, y la conjugación con el oligonucleótido tiene lugar en dicho soporte sólido; y opcionalmente a) en donde el ensamblaje de la secuencia de oligonucleótido tiene lugar en dicho soporte sólido; o b) en donde el ensamblaje de las secuencias de oligonucleótido tiene lugar a partir de la función alcohol de la esfingosina por sucesivas adiciones de las nucleósido fosforamlditas.

5. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha esfingosina se hace reaccionar con un oligonucleótido activado en solución.

6. Un compuesto que consiste en un oligonucleótido conjugado con una molécula de esfingosina.

7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 en que dicho compuesto se proporciona como un ARN desnudo.

8. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7 en el que dicha esfingosina es D-esfingosina.

9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicha esfingosina se conjuga en

el extremo 3 del nucleótido, el extremo 5, o una esfingosina se conjuga a cada uno de los extremos 3 y 5 del

nucleótido.

1. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicho oligonucleótido comprende desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o ambos.

11. Un compuesto que comprende un oligonucleótido conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1, que se híbrida por complementariedad de bases con un oligonucleótido homólogo, opcionalmente en donde dicho oligonucleótido homólogo también es un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1; opcionalmente también en donde dicho oligonucleótido hibridado es un ARNpi.

12. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 11, en el que una esfingosina se conjuga en cualquiera de los siguientes:

- la cadena sentido, o

- la cadena antisentido, o

- tanto las cadenas sentido y antisentido del oligonucleótido hibridado, en donde una esfingosina se conjuga en el extremo 3, el extremo 5 o una esfingosina se conjuga en cada uno de los extremos 3 y 5 del oligonucleótido.

13. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 en el que dicho oligonucleótido tiene entre 15 y 25 nucleótidos de longitud; o en el que dicho oligonucleótido hibridado comprende una región de cadena doble de 19 nucleótidos con dinucleótidos protuberantes en 3; o en el que dicho oligonucleótido hibridado tiene una estructura de doble cadena de 19 nucleótidos con los extremos truncados.

14. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 para su uso como un medicamento.

15. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.

16. Un método para suprimir la expresión de un gen diana en una célula in vitro, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en donde el oligonucleótido del compuesto comprende una secuencia de ácido nucleico que se corresponde con una secuencia de ácido nucleico del gen diana.