Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos "ultracortos" basados en PCR.

Un método de detección de ácidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente,

que comprende:

(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente;

(b) aislar sustancialmente dichas secuencias de ácido nucleico en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 10 a 150 pares de bases; y

(c) ensayar la presencia de una o más secuencias específicas de ácidos nucleicos que no son de hospedador que han atravesado la barrera renal detectando una o más secuencias específicas de 20-50 nucleótidos de longitud, con un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa anidada, reacción en cadena de la ligasa y amplificación por desplazamiento de cadena, usando cebadores específicos con fluoróforos internamente marcados para detección por FRET.

Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos "ultracortos" basados en PCR Campo de la invención

La presente invención proporciona métodos altamente sensibles usados para el diagnóstico y control de diversas enfermedades y trastornos detectando y analizando ácidos nucleicos "ultracortos" (2-5 pares de bases) obtenidos de fluidos corporales.

Antecedentes de la invención

La muerte celular es un acontecimiento esencial en el desarrollo y funcionamiento de organismos multicelulares. En organismos adultos, la muerte celular desempeña una función complementaria a la mitosis en la regulación de poblaciones celulares. La patogénesis de numerosas enfermedades implica insuficiencia de homeostasis tisú lar que se supone que está relacionada con daños citotóxicos o pérdida de control normal de muerte celular.

Existen dos tipos principales de muerte celular, la necrosis y la apoptosis, marcados por diferentes características moleculares y morfológicas (Kerr et al., Br. J. Cáncer. 26: 239-257, 1972; Umansky, J. Theor. Biol. 97: 591-62, 1982; Umansky y Tomel, Adv Pharmacol. 41: 383-47, 1997; Ameisen, Cell Death Differ. 11: 4-1, 24; Lockshin y Zakeri, Int J Biochem Cell Biol. 36: 245-19,24; y Kroemer, et al., Cell Death and Differentlation 12: 1463-1467, 25). La necrosis se considera que es una disfunción metabólica catastrófica producida directamente por lesión molecular y/o estructural grave y conduce a inflamación y lesión secundaria a células circundantes. La apoptosis, también denominada muerte celular programada, es un fenómeno biológico muchos más frecuente que la necrosis y puede inducirse por señales específicas tales como hormonas, citocinas, por ausencia de señales específicas, tales como factores de crecimiento o de adhesión, o por lesión molecular que no causa pérdida catastrófica de integridad. La apoptosis es un resultado de una respuesta celular activa que implica el inicio de una cascada ordenada y específica de sucesos moleculares. La apoptosis conduce a la aparición de condensación y marginación distintiva de la cromatlna, a la fragmentación nuclear, a la contracción celular y al ampollamiento de las membranas. La fragmentación ¡nternucleosomal enzlmátlca de ADN nuclear es un atributo de la apoptosis, aunque algunas células mueren por apoptosis sin escisión de ADN ¡nternucleosomal (Umansky et al., Biochim Biophys Acta. 655: 9-17,1981; Arends et al., Am J Pathol. 136: 593-68, 199; y Zimmermann et al., Pharmacol Ther. 92: 57-7,21). También se han descrito otras formas más raras de muerte celular, caracterizadas por su morfología específica, por ejemplo, la denominada muerte celular autofágica.

Se sabe bien que la apoptosis, o muerte celular programada, que es una forma principal de muerte celular en organismos multicelulares, viene acompañada por fragmentación ¡nternucleosomal de ADN nuclear. Este ADN se origina en todas las células que experimentan apoptosis y por tanto en todos los tejidos del organismo. Muchos laboratorios han demostrado que, en seres humanos, una parte de este ADN aparece en sangre (Lo et al., Ann NY Acad Sci. 945: 1-7, 21; Llchtenstein et al., Ann NY Acad Sci. 945: 239-249, 21; Taback y Hoon, CurrOpin Mol Ther. 6: 273-278, 24; y Blschoff etal., Hum Reprod Update. 8: 493-5, 22). También se ha observado que este ADN fragmentado atraviesa la barrera renal (Transrenal DNAorTr-DNA)y puede detectarse en la orina (Botezatu et al., Clin Chem. 46: 178-184, 2; Su et al., J Mol Diagn. 6: 11-17, 24; y Su et al., Ann NY Acad Sci. 122: 81-89, 24).

Como herramientas de diagnóstico se ha usado ADN tanto plasmático acelular como ADN Transrenal (ADN-Tr) cuando el marcador diagnóstico está en presencia de secuencias conocidas, específicas, diferentes de ADN genómico masivo. Por ejemplo, la detección de ADN específico de tumor que resulta de mutaciones características puede usarse para diagnóstico tumoral, la detección de secuencias específicas del cromosoma Y masculino en orina o sangre de una gestante puede usarse para determinar el género masculino del feto y la detección de mutaciones características de enfermedad hereditaria puede proporcionar una herramienta para ensayos genéticos prenatales (Chan y Lo, Semin Cáncer Biol. 12: 489-496, 22; Goessl, Expert Rev Mol Diagn. 3: 431-442, 23; Su et al., J Mol Diagn. 6: 11-17, 24; Wataganara y Bianchi, Ann NY Acad Sci. 122: 9-99, 24; Botezatu et al., Clin Chem. 46: 178-184, 2; y Ding etal., Proc Nati Acad Sci USA. 11: 1762-1767,24).

El destino del ARN de células muertas, en particular los mecanismos de su degradación, se investiga mucho menos. Sin embargo, se sabe que el ARN fetal puede detectarse en plasma de gestantes y que el ARN con mutaciones específicas de tumores puede detectarse en plasma de pacientes con diferentes tipos de cáncer (Tsui et al., Ann NY Acad Sci. 26; 175: 96-12; Lo y Chiu, Nat Rev Genet. 8: 71-77, 27; y Tsang y Lo, Pathology 39: 197-27, 27).

El documento W28/4555 describe composiciones, métodos y kits para aislar ácidos nucleicos de fluidos corporales usando medios de intercambio aniónico.

Estos biomarcadores de ácido nucleico específicos a menudo son muy cortos y su concentración en fluidos corporales es normalmente baja, especialmente si se aborda un ensayo en una fase temprana de la gestación o de

una enfermedad. Por tanto, se requieren nuevos métodos para detectar estos biomarcadores sensibles. La presente invención aborda esta necesidad en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método de detección de ácidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas al tracto urinario en un paciente, que incluye la obtención de una muestra de orina del paciente; aislar sustancialmente dichos ácidos nucleicos en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 1 a 15 pares de bases; y analizar la muestra de orina para detectar una o más secuencias específicas de ácidos nucleicos que no son del paciente que son diferentes de las secuencias de ácidos nucleicos del paciente y que han atravesado la barrera renal comprendiendo el análisis la etapa de detectar dicha una o más secuencias específicas en los ácidos nucleicos de 2-5 nucleótidos de longitud de la muestra de orina.

La presente invención también proporciona un método de detección de ácidos nucleicos de un patógeno, donde los ácidos nucleicos se originan en zonas distintas al tracto urinario en un paciente, que incluye la obtención de una muestra de orina del paciente; y analizar la muestra de orina para detectar una o más secuencias específicas de ácidos nucleicos patógenos que son diferentes de las secuencias de ácidos nucleicos del paciente y son de ácidos nucleicos patógenos que tienen 2-5 nucleótidos de longitud y que han atravesado la barrera renal donde el análisis incluye la etapa de detectar la una o más secuencias específicas del patógeno.

La presente invención también proporciona un método de detección de cáncer en un paciente que incluye obtener una muestra de orina del paciente; aislar sustancialmente dichos ácidos nucleicos en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 1 a 15 pares de bases; y analizar la muestra de orina para detectar uno o más ácidos nucleicos específicos de 2-5 nucleótidos de longitud, que son indicativos de cáncer, y que han atravesado la barrera renal, donde el análisis incluye la etapa de detectar el uno o más ácidos nucleicos específicos indicativo de cáncer.

La presente invención también proporciona un método de detección de una enfermedad o trastorno genético en un feto, que incluye obtener una muestra de orina de una gestante; aislar sustancialmente dichos ácidos nucleicos en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 1 a 15 pares de bases; y analizar la muestra de orina para detectar uno o más ácidos nucleicos fetales específicos de 2-5 nucleótidos de longitud, que han atravesado las barreras placentaria y renal, donde el análisis incluye la etapa de detectar el uno o más ácidos nucleicos fetales específicos indicativo de una enfermedad genética.

La presente invención también proporciona un método de control de células, tejidos u órganos transplantados en zonas distintas al tracto urinario en un paciente, que incluye la obtención de una muestra de orina del paciente; aislar sustancialmente dichos ácidos nucleicos en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 1 a 15 pares de bases y analizar la muestra de orina para detectar una o más secuencias específicas de ácidos nucleicos que no son del paciente de 2-5 nucleótidos de longitud de las células, tejidos u órganos trasplantados que son diferentes de las secuencias de ácidos nucleicos del paciente y que han atravesado la barrera renal para... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección de ácidos nucleicos que no son de hospedador que se originan en zonas distintas a las del tracto urinario en un paciente, que comprende:

(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente;

(b) aislar sustancialmente dichas secuencias de ácido nucleico en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 1 a 15 pares de bases; y

(c) ensayar la presencia de una o más secuencias especificas de ácidos nucleicos que no son de hospedador que han atravesado la barrera renal detectando una o más secuencias específicas de 2-5 nucleótidos de longitud, con un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa anidada, reacción en cadena de la ligasa y amplificación por desplazamiento de cadena, usando cebadores específicos con fluoróforos internamente marcados para detección por FRET.

2. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos son ADN.

3. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos son ARN.

4. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos que no son de hospedador son ácidos nucleicos patógenos.

5. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos que no son de hospedador son ácidos nucleicos fetales y el método es para detectar una enfermedad genética o un trastorno en un feto, donde la muestra de orina se obtiene de una gestante y los ácidos nucleicos han atravesado las barreras placentaria y renal.

6. El método de la reivindicación 1, donde dichos ácidos nucleicos que no son de hospedador son ácidos nucleicos de células, tejidos u órganos trasplantados y el método es para controlar células, tejidos u órganos trasplantados en zonas distintas a las del tracto urinario.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende adlclonalmente reducir la degradación de ácido nucleico en dicha muestra de orina.

8. El método de la reivindicación 7, donde la reducción de la degradación de ácido nucleico comprende inhibir la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentración salina, termoinactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

ácido etilendiaminotetraacético, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecllsulfato sódico.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.

1. El método de la reivindicación 1, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos ácidos nucleicos en dicha muestra de orina por precipitación o usando un material adsorbente sólido.

11. El método de la reivindicación 4, donde el patógeno se selecciona del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma y un protozoo.

12. Un método de detección del cáncer en un paciente que comprende:

(a) obtener una muestra de orina de dicho paciente;

(b) aislar sustancialmente secuencias de ácidos nucleicos en dicha muestra, sin excluir ácidos nucleicos de 1 a 15 pares de bases; y

(c) ensayar la presencia de uno o más ácidos nucleicos específicos de 2-5 nucleótidos de longitud, que son indicativo de cáncer, y que han atravesado la barrera renal detectando una o más secuencias especificas de 2- 5 nucleótidos de longitud, con un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa anidada, reacción en cadena de la ligasa y amplificación por desplazamiento de cadena, usando cebadores específicos con fluoróforos internamente marcados para detección por FRET.

13. El método de la reivindicación 12, donde dichos ácidos nucleicos son ADN.

14. El método de la reivindicación 12, donde dichos ácidos nucleicos son ARN.

15. El método de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente reducir la degradación de ácidos nucleicos en dicha muestra de orina.

16. El método de la reivindicación 15, donde la reducción de la degradación de ácido nucleico comprende inhibir la actividad nucleasa aumentando el pH, aumentando la concentración salina, termoinactivando, o tratando dicha muestra de orina con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

ácido etilendiaminotetraacético, clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sódico.

17. El método de la reivindicación 12, donde dicha muestra de orina ha permanecido en la vejiga urinaria menos de 12 horas.

18. El método de la reivindicación 12, donde la etapa (b) comprende aislar sustancialmente dichos ácidos nucleicos, indicativo de cáncer, en dicha muestra de orina por precipitación o usando un material adsorbente sólido.

19. El método de la reivindicación 1 o 12, donde dicho ensayo es mediante reacción en cadena de la polimerasa 15 para amplificar los ácidos nucleicos específicos de 2-5 nucleótidos de longitud.

2. El método de la reivindicación 1 o 12, donde la etapa (a) comprende filtrar dicha muestra para eliminar las sustancias contaminantes.