Composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos específicos de patógenos en la orina.

Metodo para diagnosticar una infeccion por Mycobacteriutm tuberculosis en un sujeto,

que comprende detectar la presencia de un acido nucleico de Mycobacteriutm tuberculosis libre de celulas en una fraccion soluble de una muestra de orina del sujeto, diagnosticando de ese modo la infeccion por Mycobacteriutm tuberculosis.

Composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos específicos de patógenos en la orina Antecedentes de la invención

Existen en la actualidad tres tipos de sistemas de diagnóstico in vitro ampliamente utilizados para la detección de patógenos no virales. Estos son el cultivo directo del agente patógeno a partir de la muestra biológica; análisis inmunológicos basados en la detección de productos o antígenos del agente infeccioso; y análisis inmunológicos indirectos que pueden detectar los anticuerpos producidos contra el agente infeccioso durante la infección.

En el primer sistema, la principal desventaja es que se debe considerar que la muestra biológica está en riesgo de transmisión del agente patógeno. En el segundo y tercer sistema, las desventajas incluyen la recuperación de la muestra lo que es a menudo invasivo, y una muestra potencialmente infecciosa cuando se ha recogido. En el tercer sistema, una desventaja importante es que a menudo existen pocas posibilidades de discriminar entre infecciones pasadas y actuales.

Más recientemente, se han desarrollado métodos de diagnóstico molecular basados en la detección de los ácidos nucleicos del agente patógeno en las muestras de sangre o plasma, o en los cultivos celulares, tomados del paciente. Estos análisis son generalmente mucho más sensibles que los análisis inmunológicos. Sin embargo, pueden requerir la presencia de un equipo especial y personal cualificado. Además, las muestras biológicas - en el caso de plasma, sangre, o cultivos celulares -son difíciles de almacenar sin ser alterados, excepto bajo condiciones de temperatura controlada, y se consideran un riesgo biológico para el personal que las manipulan.

Recientemente, se han descrito métodos de diagnóstico molecular basados en el ADN transrrenal (ADN-Tr) para monitorizar el progreso de los trasplantes alogénicos, para diagnosticar el sexo de un feto, y para detectar la presencia de marcadores tumorales. (Botezatu et al. Clinical Chemistry 46(8): 1078-84 (2000); Su et al. Ann. NY Acad. Sci. 1022:81-89 (2004)). Por ejemplo, la Patente estadounidense N° 6.251.638 describe un método analítico para la detección de ADN fetal masculino en la orina de mujeres embarazadas. La Patente estadounidense N° 6.287.820 describe un sistema dirigido al diagnóstico de tumores, en particular de adenocarcinomas de colon y de páncreas. La Patente estadounidense N° 6.492.144 describe que el método de análisis de ácido nucleico de ADN-Tr se puede utilizar para monitorizar el progreso de los trasplantes alogénicos. La presencia de ADN transrrenal en la orina, en forma de fragmentos de ácidos nucleicos de menos de 1000 pares de bases también fue descrita en Al- Yatama et al. (2001), Prenat Diagn, 21:399-402; y en Utting, M., et al. (2002), Clin Cáncer Res, 8:35-40. Keiko Koide, et al., Prenat Diagn, 2005; 25: 604-607; Mengjun Wang, et al.., Clinical Chemistry, 2004, 50: 211-213; Y.-H. Su, et al., J. Mol. Diagn., 2004, 6: 101-107.

La presencia de ADN transrrenal ha sido explicada a través del fenómeno de la apoptosis. Durante el proceso de la muerte celular la mayoría del ADN nuclear se convierte en nucleosomas y oligómeros, (Umansky, S.R., et al. 1982, Biochim. Biophys. Acta 655:9-17), que finalmente son digeridos por macrófagos o células vecinas. Sin embargo, una parte de este ADN degradado escapa al metabolismo fagocítico, y puede encontrarse en el torrente sanguíneo (Lichtenstein, A.V., et al. 2001, ann NY Acad Sel, 945:239-249), y, como se confirma en las patentes anteriormente mencionadas, también en la orina.

La aplicación de este sistema a infecciones por microorganismos patógenos no ha sido nunca estudiada. Anteriormente, tan solo se conocía que el ADN procariótico podía ser aislado del sedimento de orina que contenía bacterias (Frasier, et al. 1992, Acta Virol, 36:83-89). Durante una infección patógena, los procariotas y parásitos son generalmente ingeridos por las células del sistema inmunológico, tales como macrófagos y células dendríticas. Los procariotas son entonces disueltos por las vesículas fagolisosomales. El ADN procariota es liberado entonces por la célula y una parte de este ADN entra en la corriente sanguínea de cualquiera de dos maneras. O bien la célula que realiza la ingestión se vuelve apoptótica y se rompe (Navarre, W.V. 2000; Cell Microbiol 2:265-273); o las vesículas fagolisosomales liberan los fragmentos del procariota (incluyendo el ADN fragmentado) en la corriente sanguínea (Friedlander, A.M. 1978, Infect Immune 22:148-154). Sin embargo, estos ácidos nucleicos fragmentados nunca han sido detectados en la orina del sujeto infectado.

La presente invención describe un método para detectar la presencia de un patógeno no viral en un sujeto a través de la detección de secuencias de ADN del patógeno en la orina del sujeto.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para el diagnóstico de una infección de un sujeto a través de la detección de la presencia de un patógeno, mediante la presencia de ácidos nucleicos del patógeno en una muestra de orina del sujeto. El método de la invención se utiliza también para validar el diagnóstico de una infección de un sujeto a través de la detección de la presencia de ácidos nucleicos de patógenos en una muestra de orina del sujeto, en donde un

diagnóstico previo ya ha sido realizado mediante un método de la presente invención u otro método de diagnóstico. El método de la invención se utiliza también para determinar la eficacia del tratamiento de una infección por patógeno no viral en un sujeto detectando la presencia o ausencia de un ácido nucleico del patógeno no viral en la orina del sujeto. Más específicamente, el método de la invención se utiliza para identificar una infección patógena no 5 viral resistente a fármacos en un sujeto, detectando la presencia o ausencia de un ácido nucleico del patógeno no viral en la orina del sujeto después de que el sujeto haya sido tratado para la infección con un fármaco. El método de la invención también se utiliza para determinar la probabilidad de una patología a partir de la infección del sujeto por un patógeno no viral en un sujeto en riesgo de ello. Más específicamente, el método de la invención se utiliza para genotipar un patógeno no viral que ha infectado a un sujeto, mediante la detección y genotipado de ácidos nucleicos 10 del patógeno en la orina del sujeto.

La invención proporciona un método para diagnosticar una infección por Mycobacterium tuberculosis en un sujeto, que comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de Mycobacterium tuberculosis libre de células en una fracción soluble de una muestra de orina del sujeto, diagnosticando de ese modo la infección por Mycobacterium tuberculosis. En un modo de realización del método para diagnosticar una infección por Mycobacterium tuberculosis 15 en un sujeto, el método además comprende la etapa de cuantificar el ácido nucleico.

En otro modo de realización del método para diagnosticar una infección por Mycobacterium tuberculosis en un sujeto, la detección se realiza mediante un método seleccionado de PCR, PCR anidada, PCR semi-anidada, hibridación, SSCP, LCR, SDA y apareamiento con sondas moleculares que son específicas para el patógeno no viral. En un aspecto de esta realización, se utiliza un conjunto de cebadores para el método, en donde el conjunto de 20 cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso. Opcionalmente, el cebador directo se selecciona de SEQ ID NOs: 34 y 39 y el cebador inverso se selecciona de SEQ ID NOs: 35, 36 y 40.

En otro modo de realización del método para diagnosticar una infección por Mycobacterium tuberculosis en un sujeto, el sujeto es un mamífero. En un aspecto de este modo de realización, el mamífero es un humano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía de las reacciones de PCR realizadas en orina humana con cebadores específicos para la b-actina humana resuelta por electroforesis.

La Figura 2 es una fotografía de reacciones de PCR realizadas en orina de conejo con cebadores específicos para b-globina de conejo resuelta por electroforesis.

La Figura 3 es una fotografía de reacciones de PCR semi-anidada realizada en orina humana a partir de pacientes 30 infectados por TB o sanos, con cebadores específicos para secuencias de Mycobacterium tuberculosis resuelta por electroforesis.

La Figura 4 es una fotografía de reacciones de PCR semi-anidada realizada en sobrenadantes y gránulos de orina humana centrifugada a partir de pacientes infectados por TB y sanos antes y después del tratamiento con cebadores específicos para secuencias de Mycobacterium tuberculosis resuelta... [Seguir leyendo]

1. Método para diagnosticar una infección por Mycobacteriutm tuberculosis en un sujeto, que comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de Mycobacteriutm tuberculosis libre de células en una fracción soluble de una muestra de orina del sujeto, diagnosticando de ese modo la infección por Mycobacteriutm tuberculosis.

2. Método según la reivindicación 1, que además comprende la etapa de cuantificar el ácido nucleico.

3. Método según la reivindicación 2, en donde dicha detección se realiza mediante un método seleccionado del grupo que consiste en PCR, PCR anidada, PCR semi-anidada, hibridación, SSCP, LCR, SDA, y apareamiento con sondas moleculares que son específicas para el patógeno no viral.

4. Método según la reivindicación 3, en donde se utiliza un conjunto de cebadores para dicho método, en donde el 10 conjunto de cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso.

5. Método según la reivindicación 4, en donde el cebador directo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 34 y 39.

6. Método según la reivindicación 4, en donde el cebador inverso se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 35, 36, y 40.

7. Método según la reivindicación 1, en donde el sujeto es un mamífero.

8. Método según la reivindicación 7, en donde el mamífero es un humano.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el ácido nucleico detectado es uno o más fragmentos de ADN de menos de 300 pb.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el ácido nucleico detectado es uno o 20 más fragmentos de ADN de 200 pb o menos.