Composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos específicos virales en la orina.

Un método para el diagnóstico de una infección viral en un sujeto,

comprendiendo tal método la separación de una fracción libre de células de una muestra de orina de dicho sujeto y la detección de la presencia de uno o más ácidos nucleicos virales transrrenal en dicha fracción libre de células, diagnosticando de ese modo un infección viral en dicho sujeto, en donde dicho ácido nucleico viral transrrenal es un fragmento o fragmentos más pequeños de aproximadamente 1000 pares de bases o 1000 nucleótidos si está desnaturalizado.

Composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos específicos virales en la orina

Antecedentes de la invención Existen en la actualidad tres tipos de sistemas de diagnóstico in vitro ampliamente utilizados para la detección de patógenos. Estos son cultivo directo del agente patogénico de la muestra biológica; análisis inmunológicos basados en la detección de productos o antígenos del agente infeccioso; y análisis inmunológicos indirectos que pueden detectar los anticuerpos producidos contra el agente infeccioso durante la infección.

En el primer sistema, la principal desventaja es que se debe considerar que la muestra biológica está en riesgo de transmisión del agente patogénico. En el segundo y tercer sistemas, las desventajas incluyen la recuperación de la muestra que a menudo es un muestra invasiva y potencialmente infecciosa cuando se recoge. En el tercer sistema, una desventaja importante es que a menudo existe una pequeña posibilidad de discriminar entre infecciones pasadas y actuales.

Más recientemente, se han desarrollado métodos de diagnóstico molecular basados en la detección de los ácidos nucleicos del agente patogénico en las muestras de sangre o plasma, o en los cultivos celulares, tomados del paciente. Estos análisis son generalmente mucho más sensibles que los análisis inmunológicos. Sin embargo, pueden requerir la presencia de un equipo especial y personal cualificado. Además, las muestras biológicas - en el caso del plasma, la sangre, o los cultivos de células -son difíciles de almacenar inalterados, excepto bajo condiciones de temperatura controlada, y se considera que suponen un riesgo biológico para el personal que las manipulan.

Recientemente, se han descrito métodos de diagnóstico molecular basados en el ADN transrrenal (Tr-ADN) para el seguimiento del progreso de los trasplantes alogénicos, para diagnosticar el sexo de un feto, y para detectar la presencia de marcadores tumorales. (Botezatu et al. Clinical Chemistr y 46 (8) :1078-84 (2000) ; Su et al. Ann. NY Acad. Sci. 1022:81-89 (2004) ) . Por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.251.638 se describe un método analítico para la detección de ADN fetal masculino en la orina de mujeres embarazadas. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.287.820 se describe un sistema destinado al diagnóstico de tumores, en particular de los adenocarcinomas de colon y de páncreas. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.492.144 se ilustra que se puede utilizar el método de análisis de ácido nucleico Tr-ADN para realizar un seguimiento del progreso de los trasplantes alogénicos. La presencia de ADN transrrenal en la orina, en forma de fragmentos de ácidos nucleicos de menos de 1.000 pares de bases también fue descrita por Al-Yatama et al. (2001) , en Prenat Diagn, 21:399-402; y Utting, M., et al. (2002) , Clin Cancer Res, 8:35-40. Keiko Koide, et al, Prenat Diagn, 2005; 25: 604-607; Mengjun Wang, et al., Clinical Chemistr y , 2004, 50: 211-213; Y. H. Su, et al., J. Mol. Diagn, 2004, 6:101-107.

La presencia de ADN transrrenal ha sido explicada como el resultado del fenómeno de la apoptosis. En el proceso de la apoptosis o muerte celular programada el ADN nuclear se escinde en nucleosomas y oligómeros, que posteriormente, como una parte del proceso de apoptosis, son fagocitados y retirados del organismo. (Umansky, SR, et al. (1982) ; Biochim. Biophys. Acta, 655:9-17) . Una parte de este ADN degradado, sin embargo, escapa a la fagocitosis, y aparece en el torrente sanguíneo (Lichtenstein, A.V., et al. (2001) , Ann NY Acad Sci, 945:239-249) , y, como se confirma en las patentes anteriormente mencionadas, también en la orina.

La presencia de ADN viral que se origina a partir de fuentes fuera de las vías urinarias, en la orina no se había descrito con anterioridad a esta solicitud. Se ha demostrado la circulación de ADN viral liberado del genoma de células transfectadas en el plasma. Por ejemplo, se detectaron fragmentos de ADN viral de Epstein-Barr en el plasma de pacientes con carcinoma nasofaríngeo (Chan, K.C., et al. (2002) , Cáncer Res. 63:2028-2032) . Además, el virus de ADN viral del papiloma humano (VPH) se ha detectado en el plasma de pacientes con cáncer de cuello uterino (Pornthanakasem, W., et al. (2001) ; BMC Cancer 1:2) . Sin embargo, estos ADN virales no se detectaron en la orina de los pacientes.

La presente invención describe un método para detectar la presencia de patógenos virales en un sujeto a través de la detección de secuencias de ADN de los patógenos en la orina del sujeto.

Compendio de la invención La presente descripción se refiere a métodos para el diagnóstico y el seguimiento de infecciones virales en un sujeto mediante la detección y cuantificación de secuencias específicas de ácido nucleico viral transrrenal en la orina de los sujetos. En una realización, los ácidos nucleicos se aíslan o purifican. Esta purificación puede llevarse a cabo utilizando métodos químicos o físicos. Estos métodos incluyen la extracción con disolventes orgánicos, filtración, precipitación, absorción en matrices sólidas que tienen afinidad por los ácidos nucleicos, y cromatografía. Las matrices sólidas utilizadas en estos métodos se pueden construir a partir de resinas basadas en sílice, resinas de intercambio iónico, o hidroxiapatita. En otra realización, la matriz sólida es una resina a base de sílice, y dicho aislamiento o purificación se llevan a cabo en presencia de un agente caotrópico. En otra realización, se añaden uno o más agentes a la muestra de orina que inhiben la degradación de los ácidos nucleicos. Estos agentes incluyen agentes quelantes de iones, agentes desnaturalizantes y detergentes iónicos. Un ejemplo de un agente quelante de iones utilizado en los métodos de la invención es el EDTA. Los ejemplos de los agentes desnaturalizantes utilizados en los métodos de la invención son guanidina-HCl o isotiocianato de guanidina. Los ejemplos de los detergentes no iónicos utilizados en los métodos de la invención son N-laurilsarcosina o dodecilsulfato de sodio. En una realización, los ácidos nucleicos aislados o purificados se utilizan para la detección de ácidos nucleicos virales.

En otras realizaciones, el método también incluye el fraccionamiento de la muestra de orina, por ejemplo, por medio de centrifugación o filtración, con la separación de una fracción libre de células a partir de una fracción asociada con los cuerpos de las células.

El análisis de los ácidos nucleicos se lleva a cabo utilizando una de las siguientes técnicas: hibridación de los ácidos nucleicos, reacción con sonda por ciclos, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) , PCR semi-anidada, polimorfismos de conformación de cadena sencilla, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra, y polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. En otra realización, la PCR se realiza utilizando uno o más cebadores que son específicos para los genes GAG o POL de VIH-1. Los ejemplos de estos cebadores se describen en la memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1-11.

En otra realización, los ácidos nucleicos virales tienen un tamaño menor de aproximadamente 1000 pb. En una realización preferida, los ácidos nucleicos virales tienen un tamaño entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 pb.

Los métodos de la invención son aplicables a todos los agentes patogénicos virales, incluyendo virus con ARN, ADN, episómicos, e integradores. También se aplican a los virus recombinantes, tales como los adenovirus o lentivirus utilizados en la terapia génica. En particular, los métodos se aplican a los siguientes virus: retrovirus, incluyendo de VIH-1, VIH-2, virus de la viruela, virus de la poliomielitis, virus del herpes simple (HSV) , virus de Epstein-Barr (VEB) , el virus de la hepatitis C (VHC) , virus de la hepatitis B (VHB) y adenovirus (AAV) recombinantes y naturales. En algunas realizaciones los agentes virales son el virus de Epstein-Barr (VEB) y el VIH-1. En una realización, los métodos de la invención se realizan in vitro.

En otra realización, la invención se refiere a un método para el seguimiento de una infección viral en un sujeto, incluyendo las etapas de cuantificación de la cantidad de un ácido nucleico viral transrrenal en una primera muestra de orina de dicho sujeto; cuantificación de la cantidad de dicho ácido nucleico viral transrrenal en una segunda muestra de orina de dicho sujeto, y comparación de la cantidad de dicho ácido nucleico viral transrrenal en dicha primera y dicha segunda muestra de orina de dicho sujeto, controlando de este modo dicha infección viral en dicho sujeto. En otro aspecto de esta realización,... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico de una infección viral en un sujeto, comprendiendo tal método la separación de una fracción libre de células de una muestra de orina de dicho sujeto y la detección de la presencia de uno o más ácidos nucleicos virales transrrenal en dicha fracción libre de células, diagnosticando de ese modo un infección viral en dicho sujeto, en donde dicho ácido nucleico viral transrrenal es un fragmento o fragmentos más pequeños de aproximadamente 1000 pares de bases o 1000 nucleótidos si está desnaturalizado.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos ácidos nucleicos virales transrrenal son ADN.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de cuantificación de dichos ácidos nucleicos virales transrrenales.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha cuantificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado del grupo que consiste en el emparejamiento con sondas moleculares que son específicas para los agentes patogénicos, hibridación, PCR, PCR anidada, PCR semi-anidada, SSCP, LCR, y SDA.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha separación se selecciona del grupo que consiste en filtración y centrifugación de dicha muestra de orina.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la longitud de dichos ácidos nucleicos virales transrrenales es menor de aproximadamente 500 pares de bases.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos ácidos nucleicos virales transrrenales comprenden fragmentos de ADN, y la longitud de dichos fragmentos es entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 pb.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de aislamiento o purificación de dichos ácidos nucleicos virales transrrenales.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha purificación se lleva a cabo a través de métodos químicos o físicos.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dichos aislamiento o la purificación se llevan a cabo utilizando un método seleccionado del grupo que consiste en extracción con disolventes orgánicos, filtración, precipitación, absorción sobre matrices sólidas que tienen afinidad por los ácidos nucleicos, y cromatografía.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dichas matrices sólidas consisten en resinas basadas en sílice, resinas de intercambio iónico, o hidroxiapatita.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha matriz sólida es una resina con una base de sílice, y dicho aislamiento o purificación se llevan a cabo en presencia de un agente caotrópico.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un tratamiento previo de la muestra de orina con uno o más agentes que inhiben la degradación de los ácidos nucleicos.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dichos agentes se seleccionan del grupo que consiste en agentes quelantes de iones, agentes desnaturalizantes, y detergentes iónicos.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dichos agentes quelantes de iones son EDTA; dichos agentes desnaturalizantes son guanidina-HCl o isotiocianato de guanidina, y dichos detergentes iónicos son N-lauril sarcosina o dodecilsulfato de sodio.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha detección de la presencia de dichos ácidos nucleicos virales transrrenales se realiza a través de una técnica seleccionada del grupo que consiste en hibridación de los ácidos nucleicos, una reacción con sonda por ciclos, PCR, SSCP, LCR y SDA.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha PCR es PCR anidada o semi-anidada.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico viral transrrenal deriva de un virus con ARN o ADN.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho virus es integrado o episómico.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho virus se selecciona del grupo que consiste en VIH-1, VIH-2, virus de la viruela, virus de la polio, virus del herpes simple (VHS) , virus de Epstein-Barr (VEB) , virus de la hepatitis C (VHC) , virus de la hepatitis B (VHB) , y adenovirus (AAV) recombinantes y naturales.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho virus se selecciona del grupo que consiste en VEB y VIH-1.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho virus es el VIH-1.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho ácido nucleico aislado o purificado se utiliza para la detección de dicho ácido nucleico viral transrrenal.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método se lleva a cabo in vitro y dicho ácido nucleico viral es un ácido nucleico de VIH.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde dicha detección de dicho ácido nucleico viral transrrenal se lleva a cabo a través de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde dicha PCR es PCR anidada o semi-anidada.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde dicha reacción en cadena de la polimerasa se realiza utilizando uno o más cebadores que son específicos para el gen GAG o POL de VIH-1.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde los uno o más cebadores se seleccionan del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1 a 11.

29. Un método para el seguimiento de una infección viral en un sujeto, comprendiendo tal método: a) separar una primera fracción libre de células de una primera muestra de orina de dicho sujeto y cuantificar la cantidad de un ácido nucleico viral transrrenal en dicha primera fracción libre de células; b) separar una segunda fracción libre de células de una segunda muestra de orina de dicho sujeto y cuantificar la cantidad de dicho ácido nucleico viral transrrenal en dicha segunda fracción libre de células; y c) comparar la cantidad de dicho ácido nucleico viral transrrenal en dicha primera y dicha segunda fracción libre de células,

controlando de ese modo dicha infección viral en dicho sujeto, en donde dicho ácido nucleico viral transrrenal es un fragmento o fragmentos más pequeños que aproximadamente 1000 pares de bases o 1000 nucleótidos si está desnaturalizado.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho sujeto está sometido a tratamiento con un compuesto que reduce o inhibe dicha infección viral.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicha infección viral es la infección por VIH y dicho compuesto es un agente anti-viral.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha cuantificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado del grupo que consiste en el emparejamiento con sondas moleculares que son específicas para los agentes patógenos, hibridación, PCR, PCR anidada, SSCP, LCR y SDA.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha separación incluye la centrifugación de dicha muestra de orina.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dichos ácidos nucleicos virales transrrenales comprenden fragmentos de ADN, y la longitud de dichos fragmentos está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 pb.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho sujeto está en riesgo de desarrollar una infección viral recurrente.

36. Un kit para la determinación de la presencia de un ácido nucleico viral transrrenal en una muestra de orina, en donde dicho ácido nucleico viral transrrenal es un fragmento o fragmentos más pequeños que aproximadamente 1000 pares de bases o 1000 nucleótidos si ésta desnaturalizado, que comprende medios para el aislamiento o purificación de dicho ácido nucleico viral transrrenal a partir de una fracción libre de células de una muestra de orina que comprende una matriz sólida y un agente que inhibe la degradación de dicho ácido nucleico viral transrrenal, y medios para la determinación de la presencia de dicho ácido nucleico viral transrrenal mediante hibridación con al menos una sonda específica para el virus.

37. El kit de acuerdo con la reivindicación 36, en donde dicha sonda específica para el virus comprende un cebador para la reacción en cadena de polimerización.

38. El kit de acuerdo con la reivindicación 37, en donde dicho cebador es específico para el gen GAG o POL del VIH-1.