Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos en orina.

Método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos que no es del huésped,

comprendiendo dicho métodola realización de un ensayo en una muestra de orina obtenida de un individuo, para una secuencia de ácidos nucleicos, que:

(i) procede del exterior del tracto urinario,

(ii) ha cruzado la barrera renal, y

(iii) no es originaria de las secuencias de ácidos nucleicos endógenas del paciente,

en el que los ácidos nucleicos contaminantes en la muestra de orina que comprenden más de 1.000 paresde bases, ó 1.000 nucleótidos en el caso de que se hayan desnaturalizado, se extraen de la muestra previamentea la detección de dicho ácido nucleico que no es del huésped.

Métodos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos en orina

La presente invención comprende métodos no invasivos para detectar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas mediante el análisis de muestras de orina para la presencia de ácidos nucleicos que han cruzado la barrera renal. Más específicamente, la presente invención comprende métodos para detectar alteraciones específicas de los ácidos nucleicos para el diagnóstico de enfermedades, tales como infecciones por patógenos. La presente exposición comprende además métodos para detectar secuencias fetales específicas de ácidos nucleicos mediante el análisis de orina materna para la presencia de ácidos nucleicos fetales. La presente exposición comprende además métodos para detectar alteraciones de ácidos nucleicos específicos para el diagnóstico de enfermedades, tales como el cáncer.

El material genético humano es una fuente muy valiosa de información. A lo largo de las últimas décadas, la investigación científica ha desarrollado muchos procedimientos para analizar y manipular este material genético (ácidos nucleicos, ADN y ARN) para una diversidad de usos. Estas aplicaciones de la biología molecular se encuentran en el corazón de numerosas técnicas médicas modernas de diagnóstico y de tratamiento. De esta manera, han adquirido la máxima importancia los medios para la obtención, aislamiento y análisis de este material genético.

Hasta el momento, la frágil naturaleza de los ácidos nucleicos, y su situación, encapsulados dentro de las células, ha provocado que la adquisición de material genético para el diagnóstico fuese en determinados casos necesariamente intrusiva. Por ejemplo, el diagnóstico de tumores con frecuencia requiere la cirugía para la obtención de células tumorales. De manera similar, los médicos llevan a cabo las amniocentesis con el fin de obtener ADN fetal para una diversidad de usos diagnósticos. Este procedimiento requiere la inserción de una aguja a través del abdomen de una mujer embarazada y en el interior del saco amniótico. Estas prácticas intrusivas comportan un nivel de riesgo tanto para el feto como para la madre. Aunque los avances en los ultrasonidos han dado lugar a procedimientos alternativos menos intrusivos de seguimiento fetal durante el embarazo, estos procedimientos no resultan apropiados para diagnosticar determinados defectos genéticos y no resultan efectivos durante las etapas tempranas del embarazo, ni siquiera para determinar el sexo fetal.

Unos estudios recientes sobre diversos mecanismos y consecuencias de la muerte celular han revelado una potencial alternativa a las técnicas invasivas descritas anteriormente. Se encuentra bien establecido que la muerte celular apoptótica con frecuencia se ve acompañada por la fragmentación internucleosómica específica del ADN nuclear. Sin embargo, no se ha investigado en detalle cuál es el destino de estos productos de degradación de la cromatina en el organismo.

Basándose en la morfología de las células moribundas, se cree que existen dos tipos diferenciados de muerte celular: la necrosis y la apoptosis (Kerr, J.F. et al., Br. J. Cancer 26:239-257, 1972) . La muerte celular es un suceso esencial en el desarrollo y funcionamiento de los organismos multicelulares. En los organismos adultos, la muerte celular desempeña un papel complementario a la mitosis en la regulación de las poblaciones celulares. La patogénesis de numerosas enfermedades implica el fallo de la homeostasis de los tejidos, que se supone que se encuentra asociada a la lesión citotóxica o a la pérdida del control normal de la muerte celular. La apoptosis puede observarse durante las primeras etapas de la embriogénesis en la formación de los órganos, en la sustitución de un tejido por otro y en la reabsorción de órganos temporales.

La necrosis con frecuencia está marcada por un incremento temprano en el volumen celular total y en el volumen de los orgánulos subcelulares, seguido de la autolisis. La necrosis se considera un fallo metabólico catastrófico que resulta directamente de un daño molecular y/o estructural severo. La apoptosis es una muerte celular programada no traumática que se produce naturalmente en el desarrollo y mantenimiento normales de los tejidos y órganos sanos. La apoptosis es un fenómeno biológico mucho más prevalente que la necrosis (Kerr, J.F. et al., Br. J. Cancer 26:239-257, 1972; Umansky, S., Molecular Biology, traducido de Molekulyarnaya Biologiya, 30:285295, 1996; Vaux, D.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2239-2244, 1996; Umansky, S., J. Theor. Biol. 97:591602, 1982; Tomei, L.D. y Cope, F.D., editores, Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death, Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, New York, 1991.

La apoptosis también constituye una función biológica crítica que se produce naturalmente durante la embriogénesis, durante la selección positiva y negativa de los linfocitos T y B, durante la muerte de linfocitos inducida por glucocorticoides, durante la muerte inducida por radiación y cambios de temperatura, y durante la muerte consecuente al agotamiento de factores de crecimiento específicos. Además, la apoptosis es una parte importante de la defensa del organismo frente a la infección vírica. Se ha observado apoptosis en focos preneoplásicos encontrados en el hígado tras la retirada del promotor tumoral fenobarbital, en la involución dependiente de hormonas de tejidos y en tumores con la retirada hormonal. Muchos fármacos antitumorales, incluyendo los inhibidores de la topoisomerasa II, así como los factores de necrosis tumoral, inducen la muerte celular apoptótica. La muerte celular apoptótica se caracteriza por cambios morfológicos, tales como el encogimiento celular, la condensación y marginación de la cromatina, la formación de burbujas en el citoplasma ("blebbing") y el incremento de la permeabilidad membranal (Gerschenson et al., FASEB J. 6:2450-2455, 1992, y Cohen y Duke, Ann. Rev. Immunol. 10:267-293, 1992) . La fragmentación internucleosómica específica del ADN es una característica típica de muchas apoptosis, aunque cabe destacar que no de todas.

En las células necróticas, el ADN también se degrada, aunque ello es el resultado de la activación de enzimas hidrolíticos, que generalmente dan lugar a productos mononucleótidos y oligonucleótidos de ADN (Atanasyev,

V.N. et al., FEBS Letters 194:347-350, 1986) .

Recientemente, se han descrito etapas más tempranas de la degradación del ADN nuclear. Se ha demostrado que, tras los tratamientos pro-apoptóticos, se inicia el corte del ADN con la formación de fragmentos de ADN de elevado peso molecular, en el intervalo de 50 a 300 kilobases, el tamaño del ADN que se halla en las asas cromosómicas (Walker, P.R. et al., Cancer Res. 51:1078-1085, 1991; Brown, D.G. et al., J. Biol. Chem. 268:30373039, 1993) . Estos fragmentos de gran tamaño normalmente se degradan hasta formar nucleosomas y sus oligómeros. Sin embargo, en algunos casos de muerte celular apoptótica, sólo se observan fragmentos de ADN de elevado peso molecular (Oberhammer, F. et al., EMBO J. 12:3679-3684, 1993) . También existen datos sobre la aparición de estos fragmentos en algunos modelos de muerte celular necrótica (Kataoka, A. et al., FEBS Lett. 364:264-267, 1995) .

Los datos disponibles sobre el destino de estos productos de degradación de la cromatina en los organismos resultan de escasa utilidad. Los resultados publicados indican que únicamente pueden detectarse cantidades reducidas de ADN en el plasma o suero sanguíneo (Fournie, G.J. et al., Gerontology 39:215-221, 1993; Leon, S. et al., Cancer Research 37:646-650, 1977) . Puede resultar difícil garantizar que este ADN no se originó a partir de glóbulos blancos como resultado de su lisis durante el tratamiento de las muestras.

Dos grupos han encontrado ADN extracelular con alteraciones microsatélite específicas para el cáncer pulmonar de células pequeñas y el cáncer de cabeza y cuello en suero y plasma humanos (Chen X.Q. et al., Nature Medicine 2:1033-1035, 1996; Nawroz H. et al., Nature Medicine 2:1035-1037, 1996) . Otros han propuesto métodos para detectar secuencias oncogénicas mutadas en forma soluble en sangre (patente US No. 5.496.699, de George D. Sorenson) . Sin embargo, la utilización de sangre o plasma como fuente de ADN resulta tanto intrusiva para el paciente como problemática para el técnico diagnóstico. En particular, una concentración elevada de proteínas (aproximadamente 100 mg/ml) , así como la presencia de compuestos que inhiben la reacción... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos que no es del huésped, comprendiendo dicho método la realización de un ensayo en una muestra de orina obtenida de un individuo, para una secuencia de ácidos nucleicos, que:

(i) procede del exterior del tracto urinario,

(ii) ha cruzado la barrera renal, y

(iii) no es originaria de las secuencias de ácidos nucleicos endógenas del paciente,

en el que los ácidos nucleicos contaminantes en la muestra de orina que comprenden más de 1.000 pares de bases, ó 1.000 nucleótidos en el caso de que se hayan desnaturalizado, se extraen de la muestra previamente a la detección de dicho ácido nucleico que no es del huésped.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método diagnostica la infección por un ácido nucleico que no es del huésped, que contiene patógenos que infectan áreas diferentes del tracto urinario y que no liberan ácidos nucleicos directamente al interior del tracto urinario.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra de orina se ha mantenido en la vejiga durante menos de 12 horas.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ensayo para la presencia de dicha secuencia de ácidos nucleicos comprende aislar sustancialmente dicho ácido nucleico en dicha muestra de orina.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico en dicha muestra de orina

a) se aísla sustancialmente mediante precipitación. b) se aísla sustancialmente mediante tratamiento con un material adsorbente sólido, o c) se aísla sustancialmente mediante adsorción sobre una resina.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende la etapa de someter a ensayo la presencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos mediante hibridación, reacción de sonda cíclica, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa anidada, reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo de conformación de cadena sencilla, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena o polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha reacción en cadena de la polimerasa utiliza cebadores suficientemente complementarios para hibridarse con dicha secuencia diana.

8. Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además amplificar dicha secuencia diana de ácidos nucleicos.

9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho ácido nucleico es ADN.

10. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho ácido nucleico es ARN.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además reducir la degradación de los ácidos nucleicos en dicha muestra de orina.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la degradación de los ácidos nucleicos se reduce mediante inhibición de la actividad de nucleasa mediante incremento del pH, incremento de la concentración salina, inactivación por calor o mediante tratamiento de dicho ácido nucleico con un compuesto seleccionado de entre ácido etilendiamintetraacético, HCl de guanidina, isotiocianato de guanidina, N-lauroilsarcosina y dodecilsulfato sódico.

13. Método según la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos contaminantes en la muestra de orina que comprenden más de 300 pares de bases, ó 300 nucleótidos en el caso de que se haya desnaturalizado, resultan eliminados de la muestra previamente a la detección mediante filtración, y la etapa de someter a ensayo para ácidos nucleicos en dicha muestra de orina se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que no es del huésped se encuentra asociada a un patógeno.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicho patógeno es un virus, bacteria, hongo, micoplasma o protozoo.