Método para la preparación de dioles.

Microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático seleccionado de entre etilenglicol,

1,3-propanodiol y 1,4-butanodiol,

en el que el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático seleccionado de entre hidroxipiruvato, 4-hidroxi-2-cetobutirato y 5-hidroxi-2-cetopentanoato, respectivamente, con una enzima codificada por el gen kivD de Lactococcus lactis, siendo además el producto obtenido a partir de dicha etapa de descarboxilación reducido en el diol alifático correspondiente con una enzima codificada por el gen yqhD de Escherichia coli, y

en el que el microorganismo es modificado genéticamente para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/067994.

Solicitante: METABOLIC EXPLORER.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: BIOPOLE CLERMONT-LIMAGE 63360 SAINT BEAUZIRE FRANCIA.

Inventor/es: SOUCAILLE, PHILIPPE, BOISART,Cédric.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/53 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
  • C12N15/60 C12N 15/00 […] › Liasas (4).
  • C12N9/02 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
  • C12N9/88 C12N 9/00 […] › Liasas (4.).
  • C12P7/18 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Polioles.

PDF original: ES-2549003_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para la preparación de dioles.

La presente invención se refiere a un nuevo método para la preparación biológica de un diol que comprende cultivar un microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático, en el que el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático con dos enzimas: una enzima que presenta una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa codificada por el gen RND de lactococcus laetis y una enzima que presenta una actividad hidroxi aldehido reductasa codificada por el gen yqhD de E. coli. La invención se refiere asimismo a un microorganismo modificado para la producción de un diol alifático.

Antecedentes

La producción fermentativa de dioles cultivando microorganismos que producen dichos dioles es conocida en la técnica, incluyendo la producción fermentativa con microorganismos genéticamente modificados para una producción mejorada de los dioles. La producción de dichos dioles se describe, entre otros, en los siguientes documentos: WO 1996/035796, WO 2001/012833, WO 2004/033646, patente US n° 7.267.972. En particular, la producción de 1,3-propanodiol ya ha sido descrita, involucrando enzimas dependientes de la vitamina B12, haciendo así el procedimiento de producción muy costoso.

Por ejemplo Nakamura CE et al, Curr Opin Biotechnol., 2003; Act; 14(5): 454-9 describen la producción de 1,3- propanodiol a partir de D-glucosa mediante cepas de E. coli genomanipuladas que, entre otras, sobreexpresa la oxidorreductasa endógena codificada por el gen yqhD.

El gen yqhD se ha utilizado asimismo para la producción fermentativa de 1,4-butanodiol (documento WO 2008/115840).

Existe una necesidad continua de soluciones alternativas de microorganismos modificados, ya sea para producir dioles a partir de fuentes renovables de carbono o tener una mejora potencial en la producción de los dioles, particularmente con vías independientes de vitamina B12, o ambos.

Por ejemplo, Nakamura CE et al., Curr Opin Biotechnol. 2003; Act; 14(5): 454-9 describen la producción de 1,3- propanodiol a partir de D-glucosa mediante unas cepas de E. coli genomanipuladas, que entre otras, sobreexpresa la oxidorreductasa endógena codificada por el gen yqhD.

El gen yqhD se ha utilizado asimismo para la producción fermentativa de 1,4-butanodiol (documento WO 2008/115840). Una enzima independiente de la vitamina B12 es por ejemplo la alfa-ceto isovalerato descarboxilasa codificada por el gen KivD de Lactococcus laetis. Esta enzima sin embargo únicamente se ha utilizado hasta el momento para la producción de alcoholes superiores (Atsurni S et al., Nature 2008; 451(7174):86-90). Estas mejoras técnicas pueden ser sobre el rendimiento total del producto que se produce sobre la base de la energía necesaria para dicha producción y con el tiempo, el nivel de impurezas y subproductos que se deben controlar específicamente para el aislamiento del producto y su comercialización y uso adicional.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático, en donde el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto alifático con una enzima que tiene una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa, codificada por el gen RND de Lactococcus laetis, el producto obtenido a partir de dicho paso de descarboxilación es reducido aún más en la enzima diol alifático correspondiente que tiene una actividad hidroxi aldehido reductasa, codificada por el gen yqhD de E. coli y en donde el microorganismo es genéticamente modificado para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.

El microorganismo de la invención se selecciona generalmente de entre el grupo que consiste en una bacteria, levadura o un hongo. Preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteríaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

Se describe en la presente memoria un microorganismo que comprende un gen endógeno que codifica para una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa. Preferentemente se selecciona de entre Saccharomyces cerevisiae (Pdc1, Pdc5, Pdc6, Aro10, Th¡3); Lactococcus laetis (Kivd); Clostrídium acetobutylicum (Pdc); Arabidopsis thaliana (Pdc2, Pdc3); Pichia stipitis (Pdc1, Pdc2, Aro10); Zymomonas mobilis (Pdc); Mycobacterium tuberculosis. Este microorganismo que tiene actividad ácido 2-ceto descarboxilasa endógeno se puede modificar aún más para aumentar la expresión del gen endógeno que codifica el ácido 2-ceto descarboxilasa.

Se describe asimismo un microorganismo que no comprende un gen endógeno que codifica un ácido 2-ceto descarboxilasa. Dicho microorganismo que carece de ácido 2-ceto descarboxilasa endógeno se selecciona

preferentemente de entre Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum o Bacillus subtilis. Para tales microorganismos, el microorganismo de la invención comprende un gen heterólogo que codifica un ácido 2-ceto descarboxilasa.

Se describe asimismo un microorganismo que comprende un gen endógeno que codifica una actividad hidroxi aldehido reductasa. Preferentemente se selecciona de entre Escherichia coli (yqhD, fucO, dkgA, dkgB); Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2,...); y todos los organismos que tienen por lo menos una enzima que tiene actividad aldehido reductasa o actividad alcohol deshidrogenasa. Este microorganismo que tiene actividad hidroxi aldehido reductasa endógena se puede modificar aún más para aumentar la expresión del gen endógeno que codifica la hidroxi aldehido reductasa.

El diol alifático producido con los microorganismos de la invención es un diol alifático que presenta una cadena de alquilo lineal o ramificada que comprende de 2 a 6 átomos de carbono, preferentemente 2, 3 o 4 átomos de carbono.

En una forma de realización preferida, el diol alifático es etilenglicol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto alifático es hidroxipiruvato.

En otra forma de realización preferida, el diol alifático es 1,3-propanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto alifático es 4-hidroxi-2-cetobutirato.

En otra forma de realización preferida, el diol alifático es 1,4-butanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto- alifático es 5-hidroxi-2-cetopentanoato.

La presente invención se refiere también a un método para la bioproducción de un diol alifático, que comprende las etapas siguientes:

- cultivar un microorganismo de la invención como se describe anteriormente y a continuación en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y

- recuperar el diol alifático del medio de cultivo.

De acuerdo con la forma de realización preferida de la invención, el diol es purificado adicionalmente.

Descripción detallada de la invención

Microorganismos

El microorganismo de la invención es un microorganismo que es genéticamente modificado o manipulado genéticamente. Esto significa, de acuerdo con el significado usual de estos términos, que el microorganismo de la invención no se encuentra en la naturaleza y es modificado ya sea por introducción o deleción de nuevos elementos genéticos. Asimismo puede ser transformado forzando el desarrollo y evolución de nuevas vías metabólicas al combinar mutagénesis dirigida y evolución bajo presión de selección especifica (ver por ejemplo, el documento WO 2004/076659).

De acuerdo con la invención, el término "microorganismo" designa una bacteria, levadura o un hongo. Preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Más preferentemente, el microorganismo es una especie de Escherichia, Clostridium, Bacillus, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Todavía más preferentemente el microorganismo es ya sea la especie Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum o Clostridium acetobutylicum o Bacillus subtilis.

Un microorganismo puede expresar genes exógenos si estos genes son introducidos en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo hospedero. Transformar microorganismos con ADN exógeno es una tarea de rutina para el experto en la materia.

Unos genes exógenos pueden ser integrados en el genoma del hospedero, o ser expresados extracromosómicamente por plásmidos o vectores. Diferentes tipos de plásmidos son conocidos por el experto en la materia, que difieren con respeto a su origen de replicación y su número de copias en la célula.

Unos elementos importantes para controlar la expresión... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático seleccionado de entre etilenglicol, 1,3-propanodiol y 1,4-butanodiol,

en el que el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático seleccionado de entre hidroxipiruvato, 4-hidroxi-2-cetobutirato y 5-hidroxi-2-cetopentanoato, respectivamente, con una enzima codificada por el gen kivD de Lactococcus lactis, siendo además el producto obtenido a partir de dicha etapa de descarboxilación reducido en el diol alifático correspondiente con una enzima

codificada por el gen yqhD de Escheríchia coli, y

en el que el microorganismo es modificado genéticamente para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, seleccionado de entre el grupo que consiste en bacteria, levadura y hongo.

3. Microorganismo según una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que es seleccionado de entre Enterobacteriaceae, Clostrídiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

4. Microorganismo según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el diol alifático es el etilenglicol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es el hidroxipiruvato.

5. Microorganismo según la reivindicación 4, en el que la producción mejorada de hidroxipiruvato se obtiene mediante por lo menos una de las modificaciones siguientes:

- Atenuar la expresión de los genes gpmA y/o pgml\

- Incrementar la expresión de los genes serA y/o serC;

- Mutar el gen serA para obtener un alelo resistente a la retroalimentación;

- Incrementar la expresión de los genes yeaS o serS;

- Introducir e Incrementar la expresión del gen GPP2 de S. cerev/'s/ae;

- Atenuar la expresión de los genes sdaA y/o sdaB y/o tdcG y/o cysEy/o trpAB y/o glyA;

- Atenuar la expresión de los genes ghrA o hyi;

- Atenuar la expresión de los genes ItaE o aldA/aldB;

- Atenuar la expresión de los genes pykA y pykF,

Incrementar la expresión del gen ppsA.

6. Microorganismo según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el diol alifático es el 1,3-propanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es el 4-hidroxi-2-cetobutirato.

7. Microorganismo según la reivindicación 6, en el que la producción mejorada de 4-hidroxi-2-cetobutirato se obtiene mediante por lo menos una de las modificaciones siguientes:

Incrementar la expresión del gen ppc;

- Atenuar la expresión de los genes pckA y/o maeA y/o maeB\

Incrementar la expresión de los genes thrA y asd;

- Mutar el gen thrA para obtener un alelo resistente a la retroalimentación;

Incrementar la expresión del gen serC;

- Atenuar la expresión de los genes thrB y thrC, y/o metA y/o dapA;

- Atenuar la expresión de los genes aldA y aldB;

- Atenuar la expresión de los genes pykA o pykF,

- Incrementar la expresión del gen ppsA.

8. Microorganismo según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el diol alifático es el 1,4-butanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es el 5-hidroxi-2-cetopentanoato.

9. Microorganismo según la reivindicación 8, en el que la producción mejorada de 5-hidroxi-2-cetopentanoato se obtiene mediante por lo menos una de las modificaciones siguientes:

- Incrementar la expresión del gen ppc;

- Atenuar la expresión de los genes pckA y/o maeA y/o maeB\

- Incrementar la expresión de los genes gltA y/o icd;

- Atenuar la expresión de los genes sucAB o sucCD y/o aceA o aceB;

- Atenuar la expresión del gen arcA;

- Incrementar la expresión del gen prp£;

- Atenuar la expresión de los genes gdhA y gltB;

- Atenuar la expresión de los genes aldA y aldB;

- Atenuar la expresión de los genes ack y pta.

10. Método para la producción fermentativa de un diol alifático seleccionado de entre etilenglicol, 1,3-propanodiol y 5 1,4-butanodlol, que comprende las etapas siguientes:

- cultivar un microorganismo según una de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y

10 - recuperar el diol alifático del medio de cultivo.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el diol es purificado adiclonalmente.

12. Método según una de las reivindicaciones 10 u 11, en el que la fuente de carbono se selecciona de entre 15 hexosas, pentosas, monosacárldos, disacárldos, oligosacárldos, melaza, almidón, hemlcelulosas, gllcerol y

combinaciones de los mismos.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la fuente de carbono se selecciona de entre glucosa y sacarosa.


 

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