Enzima recombinante con sensibilidad alterada a la retroalimentación.

Método para la preparación de metionina, sus precursores o productos derivados de la misma,

en un proceso fermentativo con un microorganismo en el que la L-homoserina es convertida en O-succinilhomoserina con una homoserina transuccinilasa, que comprende la etapa de cultivar dicho microorganismo en un medio adecuado y recuperar la metionina, sus precursores o productos derivados de la misma una vez producidos, en el que la homoserina transuccinilasa es una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa mutada es una homoserina transuccinilasa que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o la secuencia homóloga que presenta una actividad de homoserina transuccinilasa y que comparte una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que comprende una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-VD y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 que corresponde a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

Enzima recombinante con sensibilidad alterada a la retroalimentación.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la utilización de enzimas homoserina transuccinilasa recombinantes con sensibilidad alterada a la retroalimentación (MetA*) y finalmente, enzimas S-adenosil metionina sintetasa recombinantes con actividad reducida (MetK*) , para la producción de metionina, sus precursores o derivados de la misma.

Antecedentes de la técnica Compuestos que contienen azufre tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para el metabolismo celular, y se producen industrialmente para su uso como aditivos alimentarios o aditivos para piensos y agentes farmacéuticos. En particular, la metionina, un aminoácido esencial, la cual no puede ser sintetizada por los animales, desempeña una función importante en muchas funciones del cuerpo. Además de su función en la biosíntesis de proteínas, la metionina está implicada en la transmetilación y en la biodisponibilidad de selenio y cinc. La metionina se usa también directamente como un tratamiento para trastornos tales como alergia y fiebre reumática. Sin embargo, la mayor parte de la metionina que se produce se añade al pienso.

Con el uso disminuido de proteínas derivadas de animales como resultado de BSE y la influenza aviar, la demanda de metionina pura se ha incrementado. Químicamente, la D, L-metionina se produce comúnmente a partir de acroleína, mercaptano de metilo y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, la mezcla racémica no funciona tan bien como la L-metionina pura como, por ejemplo, en aditivos para piensos para pollos (Saunderson, C. L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633) . La L-metionina pura puede producirse a partir de metionina racémica, por ejemplo, a través del tratamiento de N-acetil-D, L-metionina con acilasa, que incrementa dramáticamente los costes de producción. La demanda creciente de L-metionina pura, acoplada a asuntos ambientales, hace que la producción microbiana de metionina sea atractiva.

Los microorganismos han desarrollado mecanismos reguladores altamente complejos que sintonizan en forma precisa la biosíntesis de componentes de la célula, permitiendo de esta manera índices de crecimiento máximos. En consecuencia, sólo se sintetizan las cantidades requeridas de metabolitos, tales como aminoácidos, y usualmente no pueden detectarse en el sobrenadante de cultivo de cepas de tipo silvestre. Las bacterias controlan la biosíntesis de aminoácidos principalmente por inhibición de enzimas por retroalimentación, y represión o activación de la transcripción génica. Los efectores para estas vías reguladoras son en la mayoría de los casos los productos finales de las vías relevantes. En consecuencia, las estrategias para la sobreproducción de aminoácidos en microorganismos, requieren la desregulación de estos mecanismos de control.

La vía para la síntesis de L-metionina es bien conocida en muchos microorganismos (figuras 1A-1B) . La metionina se obtiene del aminoácido aspartato, pero su síntesis requiere la convergencia de dos vías adicionales, biosíntesis de cisteína y metabolismo C1 (tetrahidrofolato de N-metilo) . El aspartato es convertido en homoserina por una secuencia de tres reacciones. La homoserina puede entrar subsiguientemente a la vía de biosíntesis de treonina/isoleucina o metionina. En E. coli, la entrada en la vía de biosíntesis de metionina requiere la acilación de homoserina a succinil-homoserina. Esta etapa de activación permite la condensación subsiguiente con cisteína, que lleva a la cistationina que contiene tioéter, la cual es hidrolizada para dar homocisteína. La transferencia final de metilo que lleva a la metionina, es llevada a cabo por una metiltransferasa dependiente de B12 o independiente de B12.

La biosíntesis de metionina en E. coli es regulada por la represión y activación de genes de biosíntesis de metionina por medio de las proteínas MetJ y MetR, respectivamente (revisado en Neidhardt, F. C. (ed. en jefe) , R. Curtiss III, J.

L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger (eds.) 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology; Weissbach et al., 1991 Mol. Microbiol., 5, 1593-1597) . MetJ usa S-adenosilmetionina como un correpresor, que es producido a partir de metionina por la enzima S-adenosilmetionina sintetasa (EC 2.5.1.6) codificada por el gen esencial metK. metA, que codifica para homoserina transuccinilasa (EC 2.3.1.46) , la primera enzima única para la síntesis de metionina, es otro punto de control principal para la producción de metionina. Además de la regulación de metA por MetJ y MetR a través de la transcripción, la enzima es también regulada por retroalimentación por los productos finales metionina y S-adenosilmetionina (Lee, L. W. et al. (1966) Multimetabolite control of a biosynthetic pathway by sequential metabolites, JBC 241 (22) , 5479-5780) . La inhibición por retroalimentación por estos dos productos es sinergística, lo cual significa que bajas concentraciones de cada metabolito sólo son apenas ligeramente inhibidoras, mientras que en combinación, se ejerce una fuerte inhibición.

Los análogos de aminoácidos inhiben el crecimiento bacteriano a través de la síntesis de polipéptidos anormales, e interfiriendo con la inhibición por retroalimentación, lo cual lleva a procesos perjudiciales dentro de la célula. Se han obtenido mutantes resistentes a análogos de aminoácidos que muestran enzimas alteradas y desreguladas que

conducen a un exceso de síntesis de los metabolitos correspondientes que pueden superar al análogo. Varios grupos han usado los análogos de metionina norleucina, etionina y α-metilmetionina para generar cepas microbianas que sobreproducen metionina. Se mostró que la α-metilmetionina es un inhibidor potente de la enzima homoserina transuccinilasa MetA (Rowbur y RJ (1968) The inhibitor y effect of α-methylmethionine on Escherichia coli, J. Gen. Microbiol., 52, 223-230) . Se aislaron mutantes resistentes a la retroalimentación en Salmonella typhimurium que mapearon hacia el locus de metA (Lawrence D. A., (1972) Regulation of the methionine feedback-sensitive enzyme in mutants of Salmonella typhimurium; Lawrence, D. A., Smith, D. A., Rowbur y , R. J. (1967) Regulation of methionine synthesis in Salmonella typhimurium: Mutants resistant to inhibition by analogues of methionine, Genetics 58, 473492) . Se mostró que mutantes resistentes a norleucina mapean hacia el locus de metK (Chattopadhyay, M. K., Ghosh, A. K. y Sengupta, S. (1991) . Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli K12: a closer study with analogue resistant mutants, Journal of General Microbiology, 137, 685-691) . Los mismos autores han informado del aislamiento de mutantes de metA resistentes a la retroalimentación y mutantes resistentes a norleucina en E. coli, pero no se han descrito las mutaciones reales en metA y metK.

Se ha demostrado la función crítica de la homoserina transuccinilasa para la producción de metionina bacteriana por fermentación (Kumar, D. Garg, S. Bisaria V. S., Sreekrishnan, T. R. y Gomes, J. (2003) Production of methionine by a multi-analogue resistant mutant of Cor y nebacterium lilium, Process Biochemistr y 38, 1165-1171) . La solicitud de patente JP2000139471 describe un procedimiento para la producción de L-metionina usando mutantes en los genes metA y metK. En este caso, se ha determinado la ubicación precisa de las mutaciones. Las enzimas mutantes MetA han perdido parcialmente la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por metionina y S-adenosil-metionina. Sin embargo, sus actividades iniciales son disminuidas hasta aproximadamente 25% cuando se comparan con la enzima de tipo silvestre, y a concentraciones de metionina a 1 mM para algunos mutantes o SAM a 1 mM para otros, se pierde otro 25 a 90% de la actividad enzimática. Los mutantes de metK no fueron caracterizados enzimáticamente, pero se usaron en fermentaciones para incrementar la cantidad de metionina producida.

Breve descripción de la invención Esta invención se refiere a un método para la preparación de metionina, sus precursores o productos derivados de la misma, en un proceso fermentativo con un microorganismo, en el que la L-homoserina es convertida en O-succinilhomoserina con una homoserina transuccinilasa, que comprende la etapa de cultivar dicho microorganismo en un medio adecuado, y recuperar la metionina, sus precursores o productos derivados de la misma una vez producidos, en donde la homoserina transuccinilasa es una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida para los inhibidores de retroalimentación... [Seguir leyendo]

1. Método para la preparación de metionina, sus precursores o productos derivados de la misma, en un proceso fermentativo con un microorganismo en el que la L-homoserina es convertida en O-succinilhomoserina con una homoserina transuccinilasa, que comprende la etapa de cultivar dicho microorganismo en un medio adecuado y recuperar la metionina, sus precursores o productos derivados de la misma una vez producidos, en el que la homoserina transuccinilasa es una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa mutada es una homoserina transuccinilasa que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o la secuencia homóloga que presenta una actividad de homoserina transuccinilasa y que comparte una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que comprende una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 que corresponde a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la homoserina succiniltransferasa es seleccionada de entre una homoserina transuccinilasa de Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera y Yersinia pestis, con una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa mutada con una sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina presenta la secuencia como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido Q en la posición 63 con el aminoácido E.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa con una sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido L en la posición 62 con el aminoácido F.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que los microorganismos comprenden una enzima S-adenosilmetionina sintetasa con actividad enzimática de S-adenosilmetionina sintetasa reducida.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el microorganismo modificado es seleccionado de entre procariontes y eucariontes, preferentemente bajo procariontes y más específicamente Escherichia coli o Cor y nebacterium glutamicum.

7. Homoserina transuccinilasa mutada con una sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación Sadenosilmetionina y metionina, caracterizada por que la homoserina transuccinilasa mutada es una homoserina transuccinilasa que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o la secuencia homóloga que presenta una actividad de homoserina transuccinilasa y que comparte una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que comprende una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

8. Homoserina transuccinilasa mutada según la reivindicación 7, caracterizada por que es seleccionada de entre una homoserina transuccinilasa de Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera y Yersinia pestis, con una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

9. Homoserina transuccinilasa mutada según la reivindicación 7, caracterizada por que presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido Q en la posición 63 con el aminoácido E.

10. Homoserina transuccinilasa mutada según la reivindicación 7, caracterizada por que presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido L en la posición 62 con el aminoácido F.

11. Secuencia de nucleótidos que codifica una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina como se define en una de las reivindicaciones 7 a

10.

12. Microorganismo que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 10.

13. Microorganismo según la reivindicación 12, caracterizado por que se selecciona de entre procariontes y eucariontes, preferentemente bajo procariontes, y más específicamente Escherichia coli o Cor y nebacterium glutamicum.

14. Microorganismo según una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que el gen que codifica la

aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa está sobreexpresado, y/o el gen que codifica el represor de metionina metJ está suprimido.

15. Microorganismo según una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que la aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa está codificada por un alelo thrA desregulado por retroalimentación.

16. Microorganismo según la reivindicación 13, caracterizado por que la enzima ThrA está desregulada por retroalimentación por la mutación Phe318Ser.