Producción fermentativa de análogo hidroxi de metionina (MHA).

Procedimiento para la producción fermentativa de hidroximetionina,

que comprende las etapas siguientes:

- cultivar un microorganismo recombinante modificado para producir metionina en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno,

- recuperar la hidroximetionina del medio de cultivo,

en el que el microorganismo recombinante se cultiva en condiciones de limitación de nitrógeno

Producción fermentativa de análogo hidroxi de metionina (MHA).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido 2hidroxi4(metiltio)butírico (HMBA), un análogo del aminoácido esencial metionina, por fermentación. La fermentación es un proceso biológico en el cual un microorganismo, empleando el carbono, el azufre y el nitrógeno proporcionados en el medio de cultivo, biosintetiza un producto de interés que habitualmente se sintetiza químicamente.

Antecedentes de la técnica

El ácido 2hidroxi4(metiItio)butírico (HMBA), comúnmente denominado hidroximetionina es un análogo del aminoácido esencial metionina, y un importante aditivo para alimentos. Habitualmente se utiliza en dietas para aves de corral ya que se considera que la metionina es el primer aminoácido limitante en los alimentos comerciales a base soja y maíz.

El análogo hidroxi de metionina contiene un radical hidroxilo en el carbono a de la molécula de metionina en lugar de un grupo amlno. El HMBA tiene la fórmula:

CH3SCH2CH2CH (OH) COOH

A diferencia del aminoácido, éste no es utilizado directamente por el organismo en la síntesis de proteínas, porque es necesario convertirlo anabólicamente en el aminoácido que se ha de usar. El HMBA no se emplea en su forma pura, sino de otras diversas formas, a saber:

- una mezcla de sales de calcio y amonio del HMBA (patentes US n° 2.745.745 y n° US 2.938.53),

- soluciones acuosas ácldas (patente US n° 4.353.924),

- sales de calcio de HMBA, obtenidas mediante el proceso descrito en la patente US n° 3.175..

Hace mucho tiempo que se conoce la preparación de HMBA por vía química. Existen varias patentes pertenecientes a NOVUS International (PCT/US98/1595), MONSANTO Company (EP142488), BRITISH Telecomm (EP143) o Rhone Poulenc Animal Nutrition S.A. (US 6.18.359) que describen la hidrólisis del 2-hidroxi-4-metiltio- hidroxibutironitrilo (HMBN) en HBMA en un proceso de dos etapas. Todas estas tecnologías se basan aproximadamente en la misma materia prima y en los mismos compuestos intermedios principales.

La primera etapa consiste en poner el 2hIdroxl4metlItiobutironitrilo (HMBN) en contacto con ácido inorgánico fuerte tal como ácido clorhídrico o sulfúrico. En una etapa subsiguiente, después de la dilución con agua, se completa la hidrólisis a una temperatura más alta. El HMBA es extraído entonces con solvente orgánico, que no sea muy miscible en agua, tal como cetona, y por último se retira el solvente por electroporación.

La amida 2hidroxi4metiltiobutironitrilo (HMBN) es sintetizada por una reacción entre metil-mercapto- propionaldehído (MMP) y ácido cianhídrico (HCN) o cianuro de sodio (NaCN).

Durante los últimos años, se han desarrollado nuevos procedimientos que comprenden enzimas o material biológico. Por ejemplo, Aventis Animal Nutrition S. A. ha descrito y patentado un procedimiento para la preparación de HMBA mediante hidrólisis enzimática del compuesto intermedio 2hidroxi4metiltiobutironitrilo. La invención se basa en la bioconversión del HMBN después de poner en contacto a la molécula con material biológico inmovilizado que cuenta con actividad nitrilasa (patente US 6.18.359). Un proceso similar fue descrito por Novus respecto de la conversión enzimática del 2-hidroxi4-(metiltio)-butanonitrilo a 2hid rox¡-4-( m eti I ti o )-buta n a m i da o ácido 2-hidroxi4 (metiltio)-butanoico o sales (documento de patente W199832872).

En su búsqueda de mejorar la producción de metionina a través de microorganismos, los inventores de la presente han descubierto sorprendentemente que la hidroximetionina también puede ser producida en un microorganismo a partir de una fuente de carbono simple en un proceso fermentativo. Este es el primer informe que se tiene de una producción totalmente biológica de un análogo hidroxi de metionina.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la producción fermentativa de hidroximetionina, que comprende las etapas de:

- cultivar un microorganismo recombinante modificado para producir metionina en un medio de cultivo

apropiado, que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno,

recuperar hidroximetionina del medio de cultivo, en el que el microorganismo recombinante es cultivado en condiciones de limitación de nitrógeno.

La producción fermentativa se basa en el crecimiento de microorganismos, donde una fuente de carbono simple, generalmente un azúcar, es utilizada por los microorganismos tanto para su propio crecimiento como para la biosíntesis de un compuesto de interés.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir hidroximetionina, en el que un microorganismo recombinante optimizado para la producción de metionina produce hidroximetionina a partir de una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno.

Producto

Las expresiones hidroximetionina o análogo hidroxi de metionina o MHA o ácido 2-hidroxi4-(metiltio)butírico o ácido 2hidroxi4(metiltio) butanoico o HMTBA o HMBA o ácido DL-2-hidroxi-4-(metilmercapto) butanoico se usan indistintamente para designar el producto de fermentación.

Microorganismos

La presente invención se refiere al uso de un microorganismo optimizado para la producción de metionina, para producir hidroximetionina.

Las expresiones microorganismo para la producción de metionina o microorganismo productor de metionina o microorganismo modificado para producir metionina o microorganismo optimizado para la producción de metionina designan un microorganismo que produce niveles de metionina más altos que los microorganismos no productores, que sólo producen metionina para sus necesidades endógenas, mientras que el microorganismo modificado produce más metionina de la que es necesaria para el metabolismo del microorganismo. Los microorganismos optimizados para la producción de metionina son desde ya conocidos en la técnica, y han sido descritos en particular en las solicitudes de patente W25/11122, W27/7741 y W29/4383.

La expresión microorganismo recombinante o microorganismo modificado designa un microorganismo modificado genéticamente por la adición o supresión de genes, o modificando la regulación de la expresión de algunos genes.

De acuerdo con la invención, la cantidad de metionina producida por el microorganismo recombinante, y particularmente el rendimiento de metionina (proporción de gramos/mol de metionina producidos por gramos/mol de la fuente de carbono), es más elevada en el microorganismo modificado si se compara con el correspondiente microorganismo no modificado. Las modificaciones usuales incluyen deleción de genes por transformación y recombinación, reemplazos de genes, y sobreexpresión de genes o introducción de vectores para la expresión de genes heterólogos.

Estos microorganismos optimizados para la producción de metionina pueden producir hidroximetionina al mismo tiempo. Los inventores de la presente han observado que si los microorganismos producen más metionina, también se produce más hidroximetionina.

El microorganismo que se utiliza en la invención es una bacteria, una levadura o un hongo. Preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Más preferentemente, el microorganismo es del género Escheríchia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Incluso más preferentemente, el microorganismo es la especie Escheríchia coli o Corynebacteríum glutamicum.

Fermentación

Las expresiones proceso fermentativo, `cultivo o `fermentación se usan indistintamente para referirse al crecimiento de bacterias en un medio de crecimiento apropiado que contiene una fuente de carbono simple, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno.

En el proceso fermentativo de la invención, la fuente de carbono se usa simultáneamente para:

- producción de biomasa: crecimiento del microorganismo convirtiendo, entre otras cosas, la fuente de carbono del medio, y

- producción de hidroximetionina y/o metionina: transformación de la misma fuente de carbono en hidroximetionina y/o metionina por la biomasa.

Las dos etapas son concomitantes, y la transformación de la fuente de carbono por el microorganismo para crecer da como resultado la producción de hidroximetionina y/o metionina en el medio, dado que el microorganismo comprende una ruta metabólica que permite dicha conversión.

La fermentación es un proceso clásico que puede realizarse en condiciones aeróbicas, microaeróbicas o anaeróbicas.

1. Procedimiento para la producción fermentativa de hidroximetionina, que comprende las etapas siguientes:

- cultivar un microorganismo recombinante modificado para producir metionina en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno,

recuperar la hidroximetionina del medio de cultivo,

en el que el microorganismo recombinante se cultiva en condiciones de limitación de nitrógeno.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proporción molar de C/N del medio de cultivo es superior a 5, preferentemente superior a aproximadamente 1 y más preferentemente superior a 2.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la proporción molar de C/N está comprendida entre aproximadamente 2 y aproximadamente 25.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las siguientes etapas sucesivas:

hacer crecer un microorganismo recombinante en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno,

- cultivar el microorganismo recombinante en condiciones de limitación de nitrógeno en dicho medio de cultivo apropiado,

recuperar la hidroximetionina del medio de cultivo.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el microorganismo se cultiva en un sistema de biorreactor en dos etapas sucesivas:

crecimiento de los microorganismos durante aproximadamente de 1 h a 2 h en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno, preferentemente durante aproximadamente de 15 h a 2 h,

- cultivo de los microorganismos durante aproximadamente de 1 h a 2 h en condiciones de limitación de nitrógeno en un medio de cultivo apropiado, preferentemente durante aproximadamente de 1 h a 15 h.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo recombinante comprende por lo menos una de las siguientes modificaciones genéticas:

- expresión aumentada de los siguientes genes: metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serB, thrA* cysE, serA, serC,

- expresión atenuada de los siguientes genes: metJ, pykF, pykA, purU, yncA, ybdL.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el microorganismo recombinante comprende asimismo por lo menos una de las siguientes modificaciones:

- expresión aumentada de los genes pntAB y/o pyc;

- expresión atenuada del gen udhA.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la fuente de carbono fermentable es glucosa o sacarosa.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionito, sulfito o una combinación de las distintas fuentes.

1. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la hidroximetionina se recupera del medio de cultivo por extracción.