Microorganismos y procedimientos para la producción de 1,2-propanodiol y acetol.

Procedimiento para preparar 1,2-propanodiol en el que una Escherichia coli modificada,

útil para la producción del 1,2-propanodiol, caracterizada por que presenta:

- una actividad de metil glioxal reductasa aumentada, obtenida mediante la sobreexpresión del gen yqhD a partir de Escherichia coli,

- la eliminación de por lo menos uno de los genes edd, eda implicados en la ruta de Entner-Doudoroff,

se hace crecer en un medio de crecimiento adecuado que contiene una fuente de carbono, y el 1,2-propanodiol producido es recuperado.

Microorganismos y procedimientos para la producción de 1,2-propanodiol y acetol.

Introducción

La presente invención se refiere a un microorganismo modificado y a su utilización para la preparación de 1,2- propanodiol y/o acetol.

El 1,2-propanodiol o propilenglicol, un dialcohol C3, es un producto químico muy utilizado. Es un componente de resinas de poliéster no saturado, detergentes líquidos, refrigerantes y líquidos anticongelantes y de deshielo para aviones. El propilenglicol se ha utilizado cada vez más desde 1993-1994 como un producto de sustitución para los derivados del etileno, considerados más tóxicos que los derivados del propileno.

En la actualidad, el 1,2-propanodiol se produce químicamente mediante un procedimiento de hidratación del óxido de propileno que requiere grandes cantidades de agua. El óxido de propileno puede producirse mediante dos procedimientos: utilizando epiclorohidrina o hidroperóxido. Ambos utilizan sustancias de elevada toxicidad. Asimismo, la vía con hidroperóxido genera subproductos como el ferc-butanol y el 1-feniletanol. Para que la producción de propileno sea óptima, se debe encontrar un uso para estos subproductos. La vía química generalmente produce 1,2-propanodiol racémico, mientras que los dos estereoisómeros, (R)1,2-propanodiol y (S)1,2-propanodiol, son de interés para determinadas aplicaciones (por ejemplo materiales de inicio quirales para productos químicos y productos farmacéuticos especializados).

El acetol o hidroxiacetona (1-hldroxl-2-propanona) es un cetoalcohol C3. Este producto se utiliza como agente reductor en el teñido en tanques en la industria textil. Puede ventajosamente sustituir al azufre tradicional que contiene agentes reductores para reducir de esta forma el contenido de azufre en las aguas residuales, perjudicial para el medioambiente. El acetol es también un material de inicio en la industria química utilizado, por ejemplo, para producir polioles o moléculas heterocíclicas. Asimismo, tiene interesantes propiedades quelantes y disolventes.

En la actualidad, el acetol se produce principalmente mediante oxidación catalítica o deshidratación del 1,2- propanodiol. Se han propuesto nuevos procedimientos a partir de materias primas renovables como el glicerol (ver los documentos DE4128692 y WO 2005/095536). Actualmente, el coste de la producción química del acetol reduce sus aplicaciones industriales y mercados.

Las desventajas de los procedimientos químicos para la producción de 1,2-propanodiol y/o acetol hacen que la síntesis biológica sea una alternativa interesante. Los microorganismos caracterizan dos vías para la producción natural de estos productos a partir de azúcares.

En la primera vía, 6-desoxiazúcares (por ejemplo L-ramnosa o L-fucosa) se separan en fosfato de dihidroxiacetona y (S)-lactaldehído, que se pueden reducir a su vez en (S)-1,2-propanodiol (Badia et al, 1985). Esta vía es funcional en E. coli, pero no es económicamente viable debido al elevado coste de las desoxihexosas.

La segunda vía es el metabolismo de azúcares comunes (por ejemplo glucosa o xilosa) a través de la ruta de la glucóllsls seguida de la ruta del metilglioxal. El fosfato de dihidroxiacetona se convierte en metilglioxal, que se puede reducir a lactaldehído o acetol. Estos dos compuestos pueden someterse entonces a una segunda reacción de reducción que da lugar a 1,2-propanodiol. Esta vía es utilizada por los productores naturales de (R)-1,2-propanodiol, como Clostrídium sphenoides y Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. La Clostridium sphenoides se utiliza para producir 1,2-propanodiol a una valoración de 1,58 g/l en condiciones limitadas de fosfato (Tran Din y Gottschalk, 1985). La Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum también ha sido analizada para la producción de 1,2-propanodiol (Cameron y Cooney, 1986, Sanchez-Rivera y col, 1987). El mejor rendimiento obtenido fue una valoración de 9 g/l y una producción a partir de glucosa de 0,2 g/g. Sin embargo, es muy probable que la mejora del rendimiento obtenido con estos organismos resulte limitada debido a la falta de disponibilidad de herramientas genéticas.

Técnica anterior

La E. coli presenta las capacidades genéticas necesarias para producir 1,2-propanodiol y acetol naturalmente. El documento WO 2007/073364 describe un procedimiento para obtener microorganismos evolucionados, que presentan un actividad de "1,2-propanodiol sintasa" mejorada.

La ruta biosintética para obtener 1,2-propanodiol se inicia a partir del fosfato de dihidroxiacetona que se origina como producto intermedio en la glucólisis. Este producto intermedio metabólico se puede convertir en metilglioxal mediante la sintetasa de metilglioxal codificada por el gen mgsA (Cooper, 1984, Tótemeyer y col, 1998). El metilglioxal es un electrófilo extremadamente tóxico que puede reaccionar con los centros nucleófilos de las macromoléculas, como por ejemplo ADN, ARN y proteínas. Puede inhibir el crecimiento bacteriano y provocar la muerte celular en concentraciones muy bajas (0,3 a 0,7 mM). Por este motivo, se han analizado las vías existentes

para la desintoxicación del metilglioxal (Ferguson y col, 1998). En bacterias, especialmente en E. coli, se han identificado tres rutas:

- La primera es el sistema l-ll de glioxalasa dependiente de glutatión (codificada por los genes gloA y gloB) que convierte el metilglioxal en D-lactato en dos etapas.

- La segunda es la enzima III de glioxalasa independiente de glutatión que cataliza la conversión de metilglioxal en D-lactato.

- El tercer sistema comprende la degradación del metilglioxal mediante reductasas de metilglioxal.

Este último sistema resulta relevante para la producción de 1,2-propanodiol. El metilglioxal es un cetoaldehído C3, con un aldehido en C1 y una cetona en C2. Estas dos posiciones se pueden reducir a alcohol, produciendo respectivamente acetol (o hidroxiacetona), una molécula no quiral y lactaldehído, una molécula quiral que puede ser de forma L o D (ver la figura 1). Estas 3 moléculas (acetol, L-lactaldehído y D-lactaldehído) se pueden reducir posteriormente en la otra posición para obtener 1,2-propanodiol quiral.

Las rutas preferentemente utilizadas en E. coli no están bien establecidas en este momento. Una metilglioxal reductasa, utilizando preferentemente NADPH como cofactor, se purificó y se caracterizó parcialmente en E. coli (Saikusa y col, 1987). El producto de esta reacción resultó ser lactaldehído. Misra y col. (1996) describieron la purificación de dos actividades de metilglioxal reductasa que generan el mismo producto de acetol. Una actividad dependiente de NADPH puede ser una actividad de alcohol-deshidrogenasa mientras que la actividad dependiente de NADPH puede ser una reductasa de aldehido no específica. Altaras y Cameron (1999) demostraron que la glicerol-deshidrogenasa (GldA) codificada por el gen gldA de E. coli está activa en la reducción del metilglioxal a (R)- lactaldehído y, asimismo, en la conversión de acetol en 1,2-propanodiol.

El gen yghZ se clonó a partir de £. coli, se realizó su expresión y se caracterizó la proteína (Grant, 2003). Mostró una alta actividad específica hacia el metilglioxal con NADPH como cofactor, pero no se caracterizó el producto de la reacción. Ante una sobreexpresión, este gen confirió resistencia a la toxicidad del metilglioxal.

El gen yqhD a partir de la E. coli que codifica una alcohol deshidrogenasa se sobrerregula en una cepa de £. coli genomanipulada para la bioproducción de 1,3-proponodiol (documento WO 2004/033646). En esta cepa, la ruta de Entner-Doudoroff, como se presenta en la revisión de Conway (1992), se regula por disminución en combinación con el gen yqhD regulado por incremento.

Ko y col. (2005) investigaron de forma sistemática las 9 aldo-ceto reductasas de E. coli como candidatas para la conversión del metilglioxal en acetol. Mostraron que 4 enzimas purificadas, YafB, YqhE, YeaE y YghZ, pudieron convertir metilglioxal en acetol en presencia de NADPH. Según sus estudios, las metilglioxal reductasas YafB, YeaE y YghZ son las más importantes para el metabolismo del metilglioxal in vivo en cuanto a la desintoxicación. Di Luccio y col. (2006) demostraron que el producto del gen ydjG de E. coli está activo en el metilglioxal con NADH, pero no se realizó la caracterización del producto de la reacción.

Se describe en el documento WO 2007/115228 un procedimiento para fermentar anaeróbicamente glicerol para producir 1,2-propanodiol, en el que se sobreexpresan una glicerol deshidrogenasa y una dihidroxiacetona cinasa en un microorganismo.

El grupo de Cameron (Cameron y col, 1998, Altaras y Cameron, 1999, Altaras y Cameron, 2000) y el grupo de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar 1,2-propanodiol en el que una Escherichia coli modificada, útil para la producción del 1,2-propanodiol, caracterizada porque presenta:

- una actividad de metil glioxal reductasa aumentada, obtenida mediante la sobreexpresión del gen yqhD a partir de Escherichia coli,

- la eliminación de por lo menos uno de los genes edd, eda implicados en la ruta de Entner-Doudoroff,

se hace crecer en un medio de crecimiento adecuado que contiene una fuente de carbono, y el 1,2-propanodiol producido es recuperado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en dicha E. coli modificada, se obtiene la sobreexpresión sustituyendo el promotor natural del gen yqhD implicado en la reducción de metil glioxal con un promotor que induce un nivel más potente de expresión de por lo menos uno de dicho gen, o introduciendo copias múltiples del gen yqhD implicado en la reducción de metil glioxal en el interior del microorganismo.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que en dicha E. coli modificada, es aumentada la actividad de metil glioxal sintasa mediante la sobreexpresión del gen mgsA o mediante una mutación específica introducida en el interior del gen mgsA.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en dicha E. coli modificada, es atenuada la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes implicados en la conversión del metilglioxal en lactato: gloA, aldA, aldB.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en dicha E. coli modificada, es atenuada la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes implicados en la síntesis de lactato, formato o etanol: IdhA, pflA, pflB, adhE.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en dicha E.coli modificada, es atenuada la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes implicados en la síntesis del acetato: ackA, pta, poxB.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en dicha E. coli modificada, es atenuada la actividad de gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa atenuando la expresión del gen gapA.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que en dicha E. coli modificada, es aumentada la eficacia de la importación de azúcar aumentando la expresión de por lo menos un gen implicado en un sistema de importación de azúcar independiente del fosfoenolpiruvato y seleccionado de entre galP y glk.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que en dicha E. coli modificada, es mejorada la eficacia del sistema azúcar-fosfotransferasa aumentando la disponibilidad del metabolito fosfoenolpiruvato, en el que:

- es atenuada la expresión de por lo menos un gen que codifica la enzima piruvato cinasa y seleccionado de entre pykA y pykF y/o,

- es aumentada la expresión del gen ppsA que codifica la fosfoenolpiruvato sintasa.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que en dicha E. coli modificada:

- es aumentada la actividad de glicerol deshidrogenasa aumentando la expresión del gen gldA y/o,

- es aumentada la actividad de 1,2-propanodiol oxidorreductasa aumentando la expresión del gen fucO.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en dicha £. coli modificada, el gen Ipd presenta una mutación puntual que conduce a una sustitución de la alanina 55 por la valina.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en dicha £. coli modificada:

- la actividad de triosa fosfato isomerasa es atenuada atenuando la expresión del gen tpiA y/o,

- la expresión de por lo menos un gen seleccionado de entre arcA y ndh es atenuada.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el 1,2-propanodiol recuperado es además purificado.

14. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 13, en el que el acetol es recuperado y purificado.

15. E. coli modificada útil para la producción de 1,2-propanodiol y/o acetol a partir de una fuente de carbono, en la que dicha cepa está caracterizada por que presenta:

- un actividad de metil glioxal reductasa aumentada, obtenida a partir de la sobreexpresión del gen yqhD de Escherichia coli,

- un actividad de metilglioxal sintasa aumentada, obtenida mediante la sobreexpresión del gen mgsA, y

- la eliminación de por lo menos uno de los genes edd, eda implicados en la ruta de Entner-Doudoroff.