Procedimiento para la preparación de metionina y sus precursores homoserina o succinilhomoserina que utiliza un microorganismo.

Procedimiento para la producción de metionina, sus derivados o precursores mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre,

y la recuperación de la metionina a partir del medio de cultivo, en el que:

- la expresión del gen cysE, involucrado en la producción de cisteína, está aumentada en el microorganismo, y

- la expresión del gen metH, involucrado en la producción de unidades C1 y la transferencia a la homocisteína, está aumentada y/o impulsada por un promotor heterólogo, y

- el(los) alelo(s) de homoserina succiniltransferasa (MetA), que codifica(n) enzima(s) con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la S-adenosil-metionina y/o la metionina, está(n) integrado(s) en el microorganismo.

Procedimiento para la preparación de metionina y sus precursores homoserina o succinilhomoserina que utiliza un microorganismo.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo adecuado, que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre. El microorganismo reivindicado se modifica de tal modo que se mejora la producción de cisteína y/o unidades C1, y/o se aumenta u optimiza el potencial de transferencia de las unidades C1 a la homocisteína. También se reivindica el aislamiento de la metionina o sus derivados a partir del medio de fermentación.

Técnica anterior

Los compuestos que contienen azufre, tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosil-metionina, son esenciales para el metabolismo celular y se producen a escala industrial para su utilización como aditivos en alimentos destinados al consumo humano o animal, y como productos farmacéuticos. Particularmente, la metionina, un aminoácido esencial que no puede ser sintetizado por los animales, tiene un papel importante en muchas funciones del organismo. Además de su papel en la biosíntesis de proteínas, participa en la transmetilación y la biodisponibilidad del selenio y el cinc. La metionina también se utiliza directamente como tratamiento para trastornos como la alergia y la fiebre reumática. Sin embargo, la mayor parte de la metionina que se produce se incorpora a alimentos para animales.

Tras la disminución de la utilización de proteínas derivadas de animales a consecuencia de la EEB y de la gripe aviar, ha aumentado la demanda de metionina. Desde el punto de vista químico, la D, L-metionina se produce habitualmente a partir de acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, la mezcla racémica no funciona tan bien como la L-metionina pura, por ejemplo en aditivos para piensos de pollo (Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition, 54, 621-633) . La L-metionina pura se puede producir a partir de la metionina racémica, por ejemplo, a través del tratamiento de la N-acetil-D, L-metionina con acilasa, lo que incrementa enormemente los costes de producción. La creciente demanda de L-metionina pura, unida a los aspectos medioambientales, han hecho crecer el interés por la producción microbiana de la metionina.

Los microorganismos han desarrollado mecanismos de regulación muy complejos que ajustan con precisión la biosíntesis de los componentes celulares, lo que les proporciona mayores tasas de proliferación. De este modo, únicamente se sintetizan las cantidades necesarias de metabolitos, tales como aminoácidos, y por regla general no se pueden detectar en el sobrenadante del cultivo de las cepas naturales. Las bacterias controlan la biosíntesis de los aminoácidos básicamente por retroinhibición de enzimas y por represión o activación de la transcripción de genes. En muchos casos, los efectores de estas vías de regulación son los productos finales de las vías principales. Por ello, las estrategias para la sobreproducción de aminoácidos en los microorganismos requieren la desregulación de estos mecanismos de control.

La vía para la síntesis de la L-metionina se conoce bien en muchos microorganismos. La metionina deriva del aminoácido aspartato, pero su síntesis requiere la convergencia de dos vías adicionales: la biosíntesis de cisteína y el metabolismo C1 (N-metiltetrahidrofolato) . El aspartato se convierte en homoserina a través de una secuencia de tres reacciones. A continuación, la homoserina puede entrar en la vía biosintética de treonina/isoleucina o de metionina. En la E. coli, la entrada en la vía de la metionina requiere la acilación de la homoserina a succinilhomoserina. Esta etapa de activación permite la posterior condensación con la cisteína, obteniéndose la cistationina, que contiene tioéter, la cual se hidroliza para obtener la homocisteína. La transferencia de metilo final, con la que se obtiene la metionina, se lleva a cabo a través de una metiltransferasa dependiente o independiente de la vitamina B12. La biosíntesis de metionina en la E. coli está regulada por la represión y la activación de los genes de la biosíntesis de metionina a través de las proteínas MetJ y MetR, respectivamente (descrito en Neidhardt, F. C. (editor jefe) , R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechtez y

H. E. Umbarger (eds.) , 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology; Weissbach y otros, 1991, Mol. Microbiol., 5, 1593-1597) . se sabe que la proteína MetJ, junto con su correpresor S-adenosil-metionina, regula los genes metA, metB, metC, metE y metF. Otros genes que codifican enzimas implicadas en la producción de metionina, como glyA, metE, metH y metF, son activados por la proteína MetR, mientras que el metA es reprimido por la MetR. Todas las enzimas correspondientes participan en la producción y la transferencia de unidades C1 de la serina a la metionina. El gen glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa, cataliza la conversión de serina en glicina y la transferencia concomitante de una unidad C1 a la coenzima tetrahidrofolato (THF) . La unidad C1 en forma de metileno-THF debe reducirse a metil-THF antes de que pueda transferirse a la homocisteína para producir metionina. Esta reacción está catalizada por la proteína MetF. La transferencia del grupo metilo está catalizada por la proteína MetH, a través de la vitamina B12, o directamente por la proteína MetE. Se sabe que la enzima MetH tiene una velocidad catalítica cien veces mayor que la enzima MetE. En ausencia de vitamina B12, y por consiguiente de MetH activa, la MetE puede representar hasta el 5% de las proteínas celulares totales. La presencia de MetH activa reduce la actividad de la MetE, probablemente por la reducción de la cantidad de homocisteína que normalmente activa la transcripción del gen metE a través de la MetR. Por consiguiente, la producción de metionina a través de MetH ahorra recursos importantes para la célula, al no expresar grandes cantidades de MetE. La acumulación de homocisteína es tóxica para la E. coli (Tuite y otros, 2005, J. Bacteriol., 187, 13, 4362-4371) , y al mismo tiempo tiene un efecto negativo y regulador sobre la expresión del metA a través de la MetR. Por consiguiente, es claramente necesaria una expresión fuerte de las enzimas MetH y/o MetE para una producción eficiente de metionina.

En la E. coli, el azufre reducido se integra en la cisteína y posteriormente se transfiere al precursor de la metionina O-succinil-homoserina, un proceso llamado transsulfuración (descrito en Neidhardt, F. C. (editor jefe) , R. Curtiss III,

J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger (eds.) , 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology) . La cisteína se produce a partir de O-acetil-serina y H2S por sulfhidrilación. El proceso está negativamente retrorregulado por el producto, la cisteína, que actúa sobre la serina transacetilasa, codificada por cysE. La N-acetil-serina, que se produce espontáneamente a partir de O-acetil-serina, junto con el factor de transcripción CysB, activa los genes que codifican las enzimas implicadas en el transporte de los compuestos de azufre, su reducción a H2S y su integración en el compuesto orgánico de azufre cisteína, que, como la metionina, es un aminoácido esencial.

En ausencia de cisteína, la MetB cataliza la conversión del precursor de metionina O-succinil-homoserina en amoníaco, a-cetobutirato y succinato, una reacción llamada eliminación y (Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys, 433, 166-75) . A continuación, el a-cetobutirato se puede convertir en isoleucina. Esta reacción secundaria no es deseable para la producción industrial de metionina, ya que estos dos aminoácidos son difíciles de separar. Por consiguiente, una actividad de eliminación y baja es un aspecto importante para la producción industrial de metionina. La solicitud de patente provisional US 60/650.124, presentada el 7 de febrero de 2005, describe cómo se puede reducir la eliminación y mediante la optimización de la enzima MetB. La optimización del flujo de biosíntesis de la cisteína también puede reducir la eliminación y y, por consiguiente, la producción del subproducto isoleucina, y constituye una forma de realización de la presente invención.

Descripción general de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina, sus precursores o sus productos derivados en un proceso... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de metionina, sus derivados o precursores mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre, y la recuperación de la metionina a partir del medio de cultivo, en el que:

- la expresión del gen cysE, involucrado en la producción de cisteína, está aumentada en el microorganismo, y

- la expresión del gen metH, involucrado en la producción de unidades C1 y la transferencia a la homocisteína, está aumentada y/o impulsada por un promotor heterólogo, y

- el (los) alelo (s) de homoserina succiniltransferasa (MetA) , que codifica (n) enzima (s) con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la S-adenosil-metionina y/o la metionina, está (n) integrado (s) en el microorganismo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que por lo menos un gen, involucrado en la producción de unidades C1 y/o el potencial de transferencia a la homocisteína, está sobreexpresado, seleccionándose dicho gen de entre el grupo que consiste en:

• metE, que codifica la metionina sintasa

• metF, que codifica la 5, 10-metilentetrahidrofolato reductasa

• glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa

• gcvTHP, lpd, que codifican el complejo de escisión de la glicina.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la expresión de metF está aumentada y/o el gen se expresa a partir de un promotor heterólogo.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la actividad de eliminación y se mantiene baja mediante la optimización del flujo de biosíntesis de la cisteína y se reduce así la producción del subproducto isoleucina.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la expresión de unos genes adicionales involucrados en la producción de metionina está aumentada.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la expresión de los genes que disminuyen la producción de metionina está atenuada.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el represor de la metionina codificado por el gen metJ está eliminado o mutado.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionito, sulfito, o una combinación de las diferentes fuentes.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato, o una mezcla de los dos.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la etapa de aislamiento de los aminoácidos/constituyentes deseados del caldo de fermentación y/o la biomasa que permanece opcionalmente en porciones o en la cantidad total (0-100%) en el producto final.

11. Microorganismo utilizado para la producción fermentativa de metionina o sus derivados, en el que la expresión del gen cysE involucrado en la producción de cisteína está aumentada, la expresión del gen metH, involucrado en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia a la homocisteína, está aumentada y/o impulsada por un promotor heterólogo, y el (los) alelo (s) de homoserina succiniltransferasa (MetA) que codifica (n) una (s) enzima (s) con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la S-adenosil-metionina y/o la metionina está (n) integrado (s) en dicho microorganismo.

12. Microorganismo según la reivindicación 11, en el que por lo menos un gen, involucrado en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia a la homocisteína, está sobreexpresado, seleccionándose dicho gen de entre el grupo que consiste en:

• metE, que codifica la metionina sintasa

• metF, que codifica la 5, 10-metilentetrahidrofolato reductasa

• glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa

• gcvTHP, lpd, que codifican el complejo de escisión de la glicina.

13. Microorganismo según la reivindicación 12, en el que la expresión de metF está aumentada y/o el gen se expresa a partir de un promotor heterólogo.

14. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la actividad de eliminación y se mantiene

baja mediante la optimización del flujo de la biosíntesis de cisteína y se reduce así la producción del subproducto isoleucina.

15. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la expresión de genes adicionales involucrados en la producción de metionina está aumentada. 10

16. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la expresión de genes que reducen la producción de metionina está atenuada.

17. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el represor de la metionina codificado por el 15 gen metJ está eliminado o mutado.