Procedimiento para la preparación de 1,3-propanodiol a partir de sacarosa.

Microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de 1,

3-propanodiol a partir de sacarosa, en el que el microorganismo comprende:

- una ruta metabólica de dos etapas para la producción de 1,3-propanodiol, que comprende una primera etapa de descarboxilación de 4-hidroxi-2-cetobutirato con una enzima que tiene una actividad de 2-cetoácido descarboxilasa codificada por un gen endógeno, cuya expresión está potenciada o por un gen heterólogo, y una segunda etapa de reducción del 3-hidroxipropionaldehído obtenido con una enzima que tiene actividad de hidroxi aldehído reductasa, y

- unos genes funcionales que codifican un sistema de utilización de sacarosa PTS y/o un sistema de utilización de sacarosa no PTS, que permiten al microorganismo utilizar sacarosa como la única fuente de carbono.

Procedimiento para la preparación de 1,3-propanodiol a partir de sacarosa.

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación biológica de 1,3-propanodiol a partir de sacarosa, que comprende cultivar un microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de 1,3- propanodiol, en el que el microorganismo comprende una ruta metabólica de dos etapas para la producción de 1,3- propanodiol a partir de 4-hidroxi-2-cetobutirato, que comprende una primera etapa de descarboxilación y una segunda etapa de reducción, y en el que dicho microorganismo se ha modificado para que sea capaz de usar sacarosa como la única fuente de carbono.

Antecedentes

La producción fermentativa de 1,3-propanodiol cultivando microorganismo productor de 1,3-propanodiol es conocida en la técnica. Ya se han descrito procedimientos de producción de 1,3-propanodiol que implican enzimas dependientes de la vitamina B12; estos procedimientos hacen al procedimiento de producción muy caro.

Existe la necesidad continuada de soluciones alternativas para producir 1,3-propanodiol con una ruta independiente de la vitamina B12, a partir de fuentes renovables de carbono. Además, existe la necesidad continuada de la mejora del rendimiento global de producto que se produce, basado en la energía necesaria para tal producción. Finalmente, existe la necesidad continuada de controlar el nivel de impurezas y subproductos, para el aislamiento del producto y

su comercialización y uso posterior.

El 1,3-propanodiol se produce principalmente a partir de glicerol (véase la solicitud de patente PCT/EP21/5678) y a partir de glucosa vía el glicerol intermedio. Puesto que las existencias mundiales de glicerol son limitadas, existe la necesidad de hallar otras fuentes de hidratos de carbono.

Las fuentes de carbono usadas en medios de fermentación consisten generalmente en hidratos de carbono, derivados mayoritariamente de plantas. El almidón es el hidrato de carbono de almacenamiento más abundante en las plantas.

Puesto que el coste de las sustancias químicas primarias producidas biotecnológicamente está principalmente relacionado con el coste de la materia prima (es decir, el coste del sustrato de fermentación), el uso de azúcares refinados no es una elección económicamente sostenible para la producción a escala industrial. Se necesitan sustratos más baratos que retengan un contenido elevado de azúcar fermentable. A este respecto, la sacarosa que procede de la Industria azucarera representa una buena opción.

La sacarosa se obtiene de plantas de azúcar tales como remolacha azucarera, caña de azúcar, sorgo dulce, arce azucarero, palmas azucareras o agaves azules. Los diferentes intermedios, productos o subproductos que contienen sacarosa procedentes de los procedimientos azucareros (zumo bruto, zumo depurado o aclarado, zumo espeso, jarabe de sacarosa, sacarosa pura, molasa) pueden servir como materia prima de la fermentación.

Se han caracterizado dos sistemas diferentes para la captación y utilización de sacarosa en microorganismos.

El primero se basa en un sistema de sacarosa fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP) (PTS de sacarosa), en el que la sacarosa es captada y fosforilada usando fosfoenolpiruvato (PEP) como donante para producir sacarosa-6-fosfato intracelular. Sacarosa-6-fosfato se hidroliza entonces a D-glucosa-6-fosfato y D-fructosa mediante una ¡nvertasa. D-fructosa es fosforilada posteriormente a D-fructosa-6-fosfato mediante una fructocinasa dependiente de ATP, y después puede entrar al metabolismo central. Tal sistema se ha descrito en varias especies bacterianas, grampositivas así como también gramnegativas. Entre la familia de enterobacteriáceas, más del 9% de las cepas de Klebsiella de tipo salvaje pero menos del 5% de las cepas de Escherichia y menos del 1% de las cepas de Salmonella son positivas a sacarosa.

Se ha aislado de Salmonella (Schmid et al., 1982, Schmid et al., 1988) un plásmido conjugativo pUR4 que posee los genes scrKYABR que codifican el PTS de sacarosa.

Un segundo sistema, denominado sistema no PTS, se descubrió más recientemente en E. coli EC3132 (Bockmann et al., 1992). Este sistema implica los genes cscBKAR que codifican el sistema de transporte de simporte de sacarosa:protón (CscB), una fructocinasa (CscK), una invertasa (CscA) y un represor específico de la sacarosa (CscR).

Escherichia coli K12 y sus derivados no pueden utilizar sacarosa. Sin embargo, esta capacidad puede ser conferida mediante la transferencia de los genes que codifican los dos sistemas descritos previamente. Esto se ha demostrado transfiriendo el plásmido pUR4 en £. co//K12 (Schmid etal, 1982), o diferentes plásmidos (incluyendo pKJL11-1) que poseen los genes cscBKAR en una cepa negativa a sacarosa de E. coli (Jahreis et al., 22). En cuanto a la aplicación industrial, se ha documentado la producción de triptófano a partir de sacarosa en £. coli K12 (Tsunekawa

et al., 1992), la producción de hidrógeno se mostró en E. coli que posee el plásmido pUR4 (Penfold y Macaskie, 24), y en la solicitud de patente EP 1 149 911 se dio a conocer la producción de diferentes aminoácidos mediante la transferencia de ambos sistemas, PTS y no PTS.

Sorprendentemente, combinando modificaciones genéticas que conducen a una utilización de sacarosa en cepas de E. coli incapaces de utilizar sacarosa, y una ruta biosintética específica para 1,3-propanodiol, los inventores de la presente invención fueron capaces de obtener un rendimiento mejorado de la producción de 1,3-propanodiol a partir de una fuente de carbono renovable, la sacarosa.

Descripción general de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de 1,3- propanodiol a partir de sacarosa, en el que el microorganismo comprende:

una ruta metabóllca de dos etapas para la producción de 1,3-propanodiol, que comprende una primera etapa de descarboxilación de 4-hidroxi-2-cetobutirato con una enzima que tiene una actividad de 2-cetoácido descarboxilasa, y una segunda etapa de reducción del 3-hidroxipropionaldehído obtenido con una enzima que tiene actividad de hidroxi aldehido reductasa, y

- genes que permiten al microorganismo utilizar sacarosa como la única fuente de carbono.

Según la invención, el microorganismo contiene al menos un gen que codifica un polipéptido con actividad de 2- cetoácido descarboxilasa y un gen que codifica un polipéptido con actividad de hidroxi aldehido reductasa. Esos genes pueden ser exógenos o endógenos, y pueden expresarse cromosómica o extracromosómicamente.

El microorganismo según la invención está además genéticamente modificado para permitir el uso de sacarosa como la única fuente de carbono.

Descripción detallada de la invención

Como se usa aquí, los siguientes términos se pueden usar para la interpretación de las reivindicaciones y de la memoria descriptiva.

El término sacarosa designa un disacárido de glucosa y fructosa enlazado mediante un enlace a(1,2) glucosídico, con la fórmula molecular C12H22O11. Su nombre sistemático es oc-D-glucopiranos¡l-(1<->2)-|3-D-fructofuranós¡do.

La expresión microorganismo genéticamente modificado significa que el microorganismo de la invención no se encuentra en la naturaleza, y se modifica mediante introducción o mediante supresión de nuevos elementos genéticos. También se puede transformar forzando el desarrollo y evolución de nuevas rutas metabólicas al combinar mutagénesis dirigida y evolución bajo presión de selección específica (véase por ejemplo el documento WO 24/76659).

Un microorganismo puede expresar genes exógenos si estos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo hospedante. La transformación de microorganismos con ADN exógeno es una tarea habitual para el experto en la técnica.

Los genes exógenos se pueden integrar en el genoma hospedante, o se pueden expresar extracromosómicamente mediante plásmidos o vectores. El experto en la técnica conoce diferentes tipos de plásmidos, que difieren con respecto a su origen de replicación y su número de copias en la célula.

En realizaciones específicas, los genes endógenos también se pueden modificar para modular su expresión y/o actividad, introduciendo mutaciones en la secuencia codificante para modificar el producto génico, o introduciendo secuencias heterólogas además de o en sustitución de los elementos reguladores endógenos. La modulación de un gen endógeno puede producirse por ambas vías: aumentando y/o potenciando la actividad del producto génico por un lado, o... [Seguir leyendo]

1. Microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de 1,3-propanodiol a partir de sacarosa, en el que el microorganismo comprende:

- una ruta metabólica de dos etapas para la producción de 1,3-propanodiol, que comprende una primera etapa de descarboxilación de 4-h¡drox¡-2-cetobutirato con una enzima que tiene una actividad de 2-cetoácido descarboxilasa codificada por un gen endógeno, cuya expresión está potenciada o por un gen heterólogo, y una segunda etapa de reducción del 3-hidroxipropionaldehído obtenido con una enzima que tiene actividad de hidroxi aldehido reductasa, y

- unos genes funcionales que codifican un sistema de utilización de sacarosa PTS y/o un sistema de utilización de sacarosa no PTS, que permiten al microorganismo utilizar sacarosa como la única fuente de carbono.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo se ha modificado con la introducción de los genes sc/KYABR o sc/KYAB.

3. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo se ha modificado con la introducción de los genes cscBKAR o cscBKA.

4. Microorganismo según la reivindicación 1 a 3, en el que la producción de 4-hidroxi-2-cetobutirato a partir de sacarosa está mejorada en el microorganismo.

5. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, seleccionado de entre el grupo que consiste en bacteria, levadura y hongo.

6. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.

7. Procedimiento para la producción fermentativa de 1,3-propanodiol a partir de sacarosa, que comprende las etapas siguientes:

- cultivar un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio de cultivo apropiado que comprende sacarosa, y

- recuperar 1,3-propanodiol a partir del medio de cultivo.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que 1,3-propanodiol se purifica adicionalmente.