Utilización de la sacarosa como sustrato para la producción fermentativa de 1,2-propanodiol.

Procedimiento para la producción de 1,2-propanodiol mediante fermentación,

que comprende las etapassiguientes:

- cultivar un microorganismo que produce 1,2-propanodiol en un medio adecuado que comprende una fuentede sacarosa, y

- recuperar el 1,2-propanodiol que se ha producido,

en el que el microorganismo se modifica genéticamente para poder utilizar la sacarosa como única fuente decarbono para la producción de 1,2-propanodiol, con la introducción de genes scrKYABR que codifican un sistemaPTS de utilización de sacarosa, o genes cscBKAR que codifican un sistema no PTS de utilización de sacarosa.

Utilización de la sacarosa como sustrato para la producción fermentativa de 1, 2-propanodiol.

La presente invención se refiere a los procesos de fermentación. En particular, la presente invención se refiere a la producción de 1, 2-propanodiol mediante fermentación, a partir de un medio que contiene sacarosa, en particular a partir de una biomasa vegetal, en la que el microorganismo se modifica genéticamente mediante la introducción de los genes serKYARBR o cscBKAR.

El 1, 2-propanodiol o propilenglicol, un dialcohol C3, es un compuesto químico ampliamente utilizado. Es un componente de las resinas de poliéster insaturadas, los detergentes líquidos, los líquidos refrigerantes, los fluidos anticongelantes y antiescarcha para los aviones. El propilenglicol se ha estado utilizando cada vez más desde 19931994 como un sustituto de los derivados de etileno, que se han identificado por ser más tóxicos que los derivados de propileno.

El 1, 2-propanodiol se produce actualmente mediante mecanismos químicos que utilizan un procedimiento de hidratación del óxido de propileno que consume grandes cantidades de agua. El óxido de propileno se puede producir mediante dos procedimientos, uno que utiliza epicloridrina, y el otro hidroperóxido. Ambas vías utilizan sustancias muy tóxicas. Además, la vía del hidroperóxido genera subproductos como el terc-butanol y el 1-fenil etanol. Para que la producción de propileno sea rentable, se ha de encontrar una utilización para estos subproductos. La vía química produce normalmente 1, 2-propanodiol racémico, mientras que los dos estereoisómeros (R) 1, 2-propanodiol y (S) 1, 2-propanodiol resultan interesantes para determinadas aplicaciones (por ejemplo, materiales de partida quirales para especialidades químicas y productos farmacéuticos) .

Antecedentes de la técnica Las desventajas de los procedimientos químicos para la producción de 1, 2-propanodiol hacen de la síntesis biológica una alternativa atractiva. Se han descrito dos vías para la producción natural de 1, 2-propanodiol a partir de azúcares mediante microorganismos. En la primera vía, los 6-desoxiazúcares (por ejemplo, L-ramnosa o L-fucosa) se rompen en fosfato de dihidroxiacetona y (S) -lactaldehído, que se puede reducir aún más a (S) -1, 2-propanodiol (Badia et al., 1985) . Esta vía es funcional en E. coli, pero no puede producir un procedimiento económicamente viable debido al elevado coste de las desoxihexosas. La segunda vía es el metabolismo de los azúcares comunes (por ejemplo, glucosa o xilosa) mediante la vía de glicólisis seguida por la vía de metilglioxal. La dihidroxiacetona fosfato se convierte en metilglioxal que se puede reducir a lactaldehído o a acetol. Después, estos dos compuestos pueden someterse a una segunda reacción de reducción que produce 1, 2-propanodiol. Esta vía se utiliza con productores naturales de (R) -1, 2-propanodiol, como Clostridium sphenoides y Thermoanaerobacter thermosaccharolycticum. Estos dos organismos se han utilizado para producir 1, 2-propanodiol a partir de azúcares diferentes, específicamente monosacáridos (D-glucosa, D-manosa, D-galactosa para las hexosas y D-xilosa o Larabinosa para las pentosas) o disacáridos (lactosa o celobiosa) o sus mezclas (Tran Din and Gottschalk, 1985, Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al., 1987 Altaras et al., 2001) . El mejor rendimiento obtenido fue un título de 9 g/l y un rendimiento de 0, 2 g/g de glucosa (Sanchez-Rivera et al., 1987) . Sin embargo, es probable que la mejora de los rendimientos obtenidos con estos organismos sea limitada debido a la escasez de herramientas genéticas disponibles. La misma vía de síntesis es funcional en E. coli u otras enterobacterias y el grupo de Cameron ha realizado varias investigaciones (Cameron et al., 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000) y también el grupo de Bennett (Huang et al., 1999, Berrios-Rivera et al., 2003) sobre la producción de 1, 2-propanodiol en estos organismos con fuentes de carbono limitadas a D-glucosa o D-fructosa. El mejor resultado obtenido en un fermentador alimentado por lotes fue una producción de 4, 5 g/l de 1, 2-propanodiol con un rendimiento de 0, 19 g/g de glucosa (Altaras y Cameron, 2000) . Los resultados obtenidos utilizando el mismo enfoque pero con títulos y rendimientos más bajos también se describen en la patente WO 98/37204, aunque utilizando diferentes fuentes de carbono, principalmente galactosa, lactosa, sacarosa y xilosa pero también glucosa. Los títulos obtenidos con disacáridos (lactosa y sacarosa) fueron muy bajos (6 mg/l y 7 mg/l respectivamente) . En la solicitud de patente WO 2005/073364 se describieron mejores resultados de producción con una cepa de E. coli designada racionalmente y después evolucionada. Se obtuvo un título de 1, 8 g/l, con un rendimiento de 0, 35 g/g de glucosa consumida. En la patente WO 99/28481 también se ha descrito la producción de 1, 2-propanodiol e hidroxiacetona utilizando levadura recombinante.

Las fuentes de carbono utilizadas en el medio de fermentación consisten generalmente en hidratos de carbono, principalmente derivados de plantas. La sacarosa se obtiene a partir de plantas de azúcar como la remolacha azucarera, la caña de azúcar, el sorgo dulce, el arce de azúcar o el agave azul. El almidón es el almacén de hidratos de carbono más abundante en las plantas. Las fuentes de almidón más importantes son los cereales (maíz, trigo, arroz) , la yuca, los boniatos y las patatas. La mayoría de microorganismos no metabolizan el almidón pero se puede procesar en materias primas fermentables por la industria del almidón. Los polímeros de inulina o similares a la inulina (que consisten principalmente en unidades de fructosa) son el segundo almacén más abundante de hidratos de carbono en plantas y se encuentran en la endivia, el tupinambo o la dalia. La biomasa de lignocelulosa compuesta por celulosa, hemicelulosa y lignina también es una fuente de hidratos de carbono prometedora pero todavía en desarrollo (Peters, 2006) . Puesto que los costes de los productos de los materiales químicos producidos biotecnológicamente están principalmente relacionados con el coste de la materia prima (es decir, el coste del sustrato de fermentación) , la utilización de azúcares refinados como la glucosa o la sacarosa no son una elección económicamente sostenible para una producción a escala industrial. Son necesarios sustratos menos caros que retengan un alto contenido de azúcar fermentable. En este aspecto, la sacarosa que contiene fuentes de carbono procedente de la industria azucarera representa una buena opción.

La sacarosa se produce a partir de la remolacha azucarera que contiene de 16 a 24% de sacarosa por remolacha azucarera y que se procesa en varias etapas. Las remolachas limpiadas y lavadas se cortan en trozos largos denominados cosetas (cossettes) que se extraen con agua caliente mediante difusión para obtener un zumo de sacarosa denominado zumo crudo que contiene entre un 10% y un 15% de sacarosa. La segunda etapa es la de purificación del zumo crudo mediante alcalinización o carbonatación que utiliza cal y después dióxido de carbono para extraer las impurezas y obtener el zumo fino. El proceso de evaporación incrementa la concentración de sacarosa en el zumo fino mediante la extracción de agua para mantener el zumo fino con un contenido de sacarosa de 50 a 65%. Después, este zumo concentrado de sacarosa se cristaliza y los cristales se separan mediante centrifugación y después se lavan y se secan para obtener azúcar puro. Se pueden aplicar una o más etapas de cristalización para obtener sacarosa de varios grados de pureza. Los subproductos de la remolacha azucarera incluyen la pulpa (las cosetas consumidas) y la melaza (el licor madre restante tras la cristalización que todavía presenta un contenido de sacarosa de 40 a 60%) .

La sacarosa también se produce en la industria azucarera a partir de la caña de azúcar (entre un 7 y un 20% de contenido de sacarosa) . La caña de azúcar cosechada se rompe y después se tritura y al mismo tiempo se extrae la sacarosa con agua para obtener el zumo crudo. La caña triturada consumida de azúcar se denomina bagazo. El residuo se utiliza principalmente como combustible para generar vapor procesado. Después, el zumo crudo se aclara añadiendo cal y calor y el zumo clarificado se separa del precipitado. Las últimas etapas del proceso, la evaporación para obtener un jarabe concentrado y la cristalización son esencialmente las mismas que en el caso del proceso de la remolacha azucarera. Los subproductos del procesamiento de la caña de azúcar incluyen el bagazo, la pasta húmeda del aclarado del zumo crudo y diferentes tipos de melazas, que todavía contienen una cantidad significativa de sacarosa.

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1. Procedimiento para la producción de 1, 2-propanodiol mediante fermentación, que comprende las etapas siguientes: 5

- cultivar un microorganismo que produce 1, 2-propanodiol en un medio adecuado que comprende una fuente de sacarosa, y

- recuperar el 1, 2-propanodiol que se ha producido,

en el que el microorganismo se modifica genéticamente para poder utilizar la sacarosa como única fuente de carbono para la producción de 1, 2-propanodiol, con la introducción de genes scrKYABR que codifican un sistema PTS de utilización de sacarosa, o genes cscBKAR que codifican un sistema no PTS de utilización de sacarosa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo se selecciona de entre el grupo que consiste en bacterias, levadura y hongos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el microorganismo se selecciona de entre el grupo que consiste en Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae , Streptomycetaceae y Cor y nebacteriaceae. 20

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el microorganismo se selecciona de entre el grupo que consiste en Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Clostridium sphenoides o Saccharomyces cerevisae.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha fuente de sacarosa se obtiene a partir de la biomasa.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha fuente de sacarosa se obtiene de una planta seleccionada de entre el grupo que consiste en: caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo dulce, arce de azúcar, 30 palma de azúcar y agave azul.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6, en el que dicha fuente de sacarosa se encuentra en forma de zumo, jarabe o zumo concentrado, zumo clarificado, melazas o sacarosa cristalizada.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 5 a 7, en el que dicha fuente de sacarosa es un producto final, un producto intermedio o un subproducto de la industria de la caña de azúcar o de la remolacha azucarera.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio adecuado consiste en la fuente de sacarosa. 40

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio adecuado contiene por lo menos una fuente de fósforo y/o una fuente de nitrógeno además de la fuente de sacarosa.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha fuente de sacarosa comprende 45 por lo menos 7% de sacarosa.