Método para la fabricación de degarelix.

Un método de fabricación de degarelix, Ac-D-2Nal-DPhe(4Cl)-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro- D-Ala-NH2,

en donde el degarelix comprende 0,3% en peso o menos, en particular 0,1% en peso o menos, lo más particularmente 0,01% en peso o menos, de Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala- NH2, en donde X es 4-([2-(5-hidantoil)]-acetilamino)-fenilalanina, comprendiendo el método la síntesis por etapas sobre un soporte sólido que comprende un grupo amino conectado al soporte, en donde las etapas comprenden proporcionar una solución de un aminoácido o péptido del que el grupo amino en α se protege mediante Fmoc; poner en contacto el soporte con la solución en presencia de un reactivo para formar un enlace peptídico entre un grupo carboxilo del aminoácido o péptido disuelto y el grupo amino conectado al soporte durante un tiempo suficiente para formar dicho enlace peptídico; retirar el Fmoc poniendo en contacto el soporte con una base orgánica seleccionada de piperidina y piperidina sustituida con alquilo en C, en particular 2-alquilpiperidina, 3-alquilpiperidina, 2,4-dialquilpiperidina, 2,5-dialquilpiperidina, 2,6-dialquilpiperidina, en donde el alquilo es una cadena ramificada o lineal de 1 a 6 carbonos, en particular metilo o etilo, lo más particularmente metilo, en un disolvente orgánico.

Método para la fabricación de degarelix Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la fabricación de péptidos sintéticos, en particular a la fabricación del decapéptido degarelix.

Antecedentes de la invención

Existe un número de métodos conocidos disponibles para la síntesis de péptidos. Un enfoque clásico es la síntesis de péptidos en fase líquida (LPPS, por sus siglas en inglés), que ha sido un método preferido para producir grandes cantidades de péptidos. Otro enfoque actual y comúnmente usado para la síntesis de péptidos es la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés), en la que la cadena peptídica en crecimiento se liga covalentemente a una resina sobre un soporte sólido, hasta que se escinde de él una vez que se alcanza la longitud y la secuencia deseadas. En estos métodos las cadenas laterales reactivas de los aminoácidos incorporados necesitan protegerse a fin de evitar otras reacciones aparte de la formación deseada de nuevos enlaces peptídicos en el péptido en crecimiento. Además, para evitar reacciones secundarias entre los aminoácidos añadidos, así como la incorporación de múltiples aminoácidos en cada etapa, los aminoácidos añadidos se protegen normalmente en el amino en a. La síntesis se convierte así en una de ciclos repetidos de desprotección de la amina en a de un péptido ligado en fase sólida, seguido por acoplamiento a una sola unidad de aminoácido protegida en amino en a.

El degarelix es un antagonista de GnRH para el uso en el tratamiento del cáncer de próstata. El degarelix tiene un comienzo de acción inmediato y suprime gonadotropinas, testosterona y antígeno específico de la próstata (PSA). El degarelix es un decapéptido sintético de la fórmula Ac-D-2Nal-D-Phe(4CI)-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu- ILys-Pro-D-Ala-NH2

El quinto resto de aminoácido del extremo amino del degarelix corresponde al aminoácido no natural Aph(L-hor). Aph(L-Hor) indica (L-hidroorotil)-4-amino-fenilalanina. Se sabe en la técnica (Koedjikov, A. H. y cois., J. Chem. Soc. Perkin, Trans. 2, 1984, páginas 177-181; Kaneti, J. y cois., Org. Biomol. Chem., 24, páginas 198-113) que, bajo condiciones básicas, compuestos que comprenden un resto dihidrouracilo sufren una transposición hasta compuestos que comprenden un resto hidantoína. La correspondiente transposición de Aph(L-Hor) se ilustra posteriormente (arriba a la izquierda: resto dihidrouracilo N-4-(L-hidroorotilamino)-fenilalanina I, R = -CH2CHNH2COOH; abajo a la derecha: resto hidantoína II, N-4-[2-(5-hidantoil)-acetil)-fenilalanina).

En la transposición, el resto dihidrouracilo I se convierte en un resto hidantoína II. Siendo el resto L-Hor de 4Aph(L- Hor) del tipo dihidrouracilo, se espera que tal transposición se produzca durante un procedimiento de fabricación de degarelix en el que se emplean condiciones básicas. Esto fue confirmado por el solicitante poniendo en contacto

II

productos intermedios de síntesis de péptidos que comprenden un extremo 4Aph(Hor) protegido con Fmoc en el amino en a bien con NaOH o bien con la base orgánica diciclohexilamina (DCHA). Se encontró que el producto de desprotección obtenido estaba contaminado por hasta varios % en peso del correspondiente producto de transposición de hidantoína. En la síntesis de degarelix, se puede esperar así que el producto intermedio Fmoc- 4Aph(Hor)-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH-Resina se transponga parcialmente en Fmoc-X-4Aph(Cbm)-Leu-ILys- Pro-D-Ala-NH-Resina, siendo X 4-([2-(5-hidantoil)]acetilamino)-fenilalanina, cuando se desprotege bajo condiciones básicas. Por consiguiente, se puede esperar así que un producto de degarelix obtenido a través de Fmoc- 4Aph(Hor)-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-DAIa-NH-Resina esté contaminado por una cantidad correspondiente de Ac-D- 2Nal-D-Phe(4CI)-D-3Pal-Ser-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2. El degarelix es el ingrediente activo de un fármaco para la administración a seres humanos. Por lo tanto, no debe estar contaminado por ninguna impureza que supere ,3% en peso del producto. Así, en degarelix adecuado para el consumo humano, el subproducto de hidantoína no puede ser tolerado en una cantidad de más de ,3% en peso. Puesto que el subproducto que contiene resto hidantoína es estructuralmente muy similar al degarelix, su separación es difícil. Si se intenta, se espera que la separación dé como resultado una pérdida sustancial de producto. De ahí que, en un procedimiento de fabricación de degarelix de calidad farmacéutica empleando el grupo protector Fmoc, se deban evitar las condiciones básicas.

La síntesis de degarelix se divulga en US 592573 A. El grupo protector del amino en a preferido en esta síntesis y que se ha usado en todos los Ejemplos es el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc). Además, una amplia gama de otros grupos protectores muy conocidos, tales como el grupo fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) se divulga con este propósito.

Una ventaja con el grupo Boc es que los grupos amino en a protegidos por él se pueden desbloquear bajo condiciones ácidas mediante tratamiento estándar con ácido trifluoroacético (TFA).

Una desventaja con el TFA es su alta toxicidad para seres humanos, que pone en riesgo al personal de la fábrica. Otra desventaja con el TFA es su toxicidad medioambiental, que bien hace costosa la eliminación o bien, si se elimina inapropiadamente, contamina el medio ambiente.

Objetivos de la invención

Un objetivo de la invención es proporcionar un método para la fabricación de degarelix, que no ponga en riesgo la salud humana, en particular que sea menos nocivo para la salud humana que el método divulgado en US 592573 A.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para la fabricación de degarelix, que no ponga en riesgo el medio ambiente, en particular que sea menos nocivo para el medio ambiente que el método divulgado en US 592573 A.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un método para la fabricación de degarelix, que sea menos costoso que los métodos conocidos en la técnica.

Objetivos adicionales de la invención se harán evidentes a partir del siguiente compendio de la invención, un número de realizaciones preferidas divulgadas en forma de ejemplos, y las reivindicaciones adjuntas.

Compendio de la invención

Los inventores han encontrado sorprendentemente que se puede fabricar degarelix farmacéuticamente puro mediante síntesis en fase sólida usando Fmoc como grupo protector de amino en a. "Farmacéuticamente puro" indica que el producto no contiene más de ,3% en peso de cualquier impureza individual. Inesperadamente, el resto Aph(L-Hor) no sufre transposición durante la síntesis en fase sólida a pesar de ser sometido a varios ciclos de protección con y desprotección de Fmoc bajo condiciones básicas.

Los aminoácidos protegidos en el amino en a con Fmoc se acoplan a la resina y a continuación entre sí de un modo por etapas, cíclico y dependiente de la secuencia. Cada etapa de acoplamiento de un aminoácido es seguida por una etapa de desprotección para retirar el grupo de protección Fmoc y permitir que se acople el siguiente aminoácido. La desprotección se consigue mediante una base. Se usa para la desprotección la base piperidina o piperidina sustituida con alquilo en un medio orgánico.

La protección de la cadena lateral se incluye preferiblemente para proteger cadenas laterales de aminoácidos que son particularmente reactivas o lábiles, para evitar reacciones secundarias y/o la ramificación de la molécula en crecimiento. Los grupos de protección de la cadena lateral se retiran una vez que se ha alcanzado la longitud total del péptido en crecimiento.

Así, según la presente invención, se divulga un método de fabricación de degarelix, Ac-D-2Nal-DPhe(4CI)-D-3Pal-

Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, en donde el degarelix comprende ,3% en peso o menos, en particular ,1% en peso o menos, lo más particularmente ,1% en peso o menos, de Ac-D-2Nal-D-Phe(4Clj-D- 3Pal-Ser-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, en donde X es 4-([2-(5-h¡dantoil)]-acetilam¡no)-fen¡lalan¡na, comprendiendo el método la síntesis por etapas sobre un soporte sólido que comprende un grupo amino conectado al soporte, en donde las etapas comprenden proporcionar una solución de un aminoácido o péptido del que un grupo amino en a se protege mediante Fmoc; poner en contacto el soporte con la solución en presencia de un reactivo para formar un enlace peptídico entre un grupo carboxilo del aminoácido o péptido disuelto y el grupo amino conectado al soporte durante un tiempo suficiente para formar dicho enlace peptídico; retirar... [Seguir leyendo]

1. Un método de fabricación de degarelix, Ac-D-2Nal-DPhe(4CI)-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro- D-Ala-NH2, en donde el degarelix comprende ,3% en peso o menos, en particular ,1% en peso o menos, lo más particularmente ,1% en peso o menos, de Ac-D-2Nal-D-Phe(4CI)-D-3Pal-Ser-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala- NH2, en donde X es 4-([2-(5-hidantoil)]-acetilamino)-fenilalanina, comprendiendo el método la síntesis por etapas sobre un soporte sólido que comprende un grupo amino conectado al soporte, en donde las etapas comprenden proporcionar una solución de un aminoácido o péptido del que el grupo amino en a se protege mediante Fmoc; poner en contacto el soporte con la solución en presencia de un reactivo para formar un enlace peptídico entre un grupo carboxllo del aminoácido o péptido disuelto y el grupo amino conectado al soporte durante un tiempo suficiente para formar dicho enlace peptídico; retirar el Fmoc poniendo en contacto el soporte con una base orgánica seleccionada de piperidina y piperidina sustituida con alquilo en C, en particular 2-alquilpiperidina, 3-alquilpiperidina, 2,4-dlalquilplperldlna, 2,5-dlalquilpiperidina, 2,6-dialquilpiperidina, en donde el alquilo es una cadena ramificada o lineal de 1 a 6 carbonos, en particular metilo o etilo, lo más particularmente metilo, en un disolvente orgánico.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la base orgánica es piperidina.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el disolvente orgánico es dimetilformamida.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el reactivo para formar un enlace peptídico comprende N,N-diisopropilcarbodi¡mida.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el grupo amino conectado al soporte es un grupo amino en a de un fragmento de degarelix conectado al soporte.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el péptido protegido por Fmoc es un fragmento de degarelix.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el soporte se selecciona de resina de amida de Rink AM y resina de amida de Rink MBHA.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende liberar degarelix del soporte mediante tratamiento con ácido.

9. Un método de fabricación de degarelix, en el que el degarelix comprende ,3% en peso o menos, en particular ,1% en peso o menos, de Ac-D-2Nal-D-Phe(4CI)-D-3Pal-Ser-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, en donde X es 4-([2-(5-hldanto¡l)]-acet¡lamlno)-fen¡lalanina, comprendiendo el método la síntesis por etapas sobre un soporte sólido que comprende un grupo amino conectado al soporte, en donde las etapas comprenden proporcionar una solución de un aminoácido o péptido del que el grupo amino en a se protege mediante Fmoc; poner en contacto el soporte con la solución en presencia de un reactivo para formar un enlace peptídico entre un grupo carboxilo del aminoácido o péptido disuelto y el grupo amino conectado al soporte durante un tiempo suficiente para formar dicho enlace peptídico; retirar el Fmoc poniendo en contacto el soporte con piperidina en un disolvente seleccionado de dimetilformamida, dietilformamida, N,N-d¡metilacetam¡da, N-metilpirrolidona.

1. El método según la reivindicación 9, en el que dicho reactivo es N,N-düsoprop¡lcarbodiim¡da.