Proteína para inmunocastración de mamíferos.

Proteína de fusión que incorpora la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) para la immunocastración de mamíferos,

secuencias de ADN que codifican dicha proteína de fusión, vacuna que comprende dicha proteína de fusión, y procedimiento para preparar la proteína de fusión. La proteína de fusión incorpora la secuencia aminoacídica de la GnRH fusionada a una secuencia de acuerdo a la SEQ ID No. 14, no derivada de patógeno, con capacidad inmunogénica y que contiene sitios de O-glicosilación.

Proteína para inmunocastración de mamíferos Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la Ingeniería Genética y Biotecnología y, en particular, al uso de un 5 polipéptido que incorpora la secuencia de aminoácidos de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-I) para la inmunocastración de mamíferos.

Breve resumen de la invención El polipéptido de la presente invención es un polipéptido quimérico o glicopéptido, formado por la fusión de la secuencia de aminoácidos de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-I) o sus variantes, y una secuencia teórica no derivada de patógeno que mejora la inmunogenicidad de GnRH. La presente proteína de fusión, su versión glicosilada, así como sus repeticiones en tándem, pueden usarse junto con distintos tipos de adyuvantes para la inmunoneutralización de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-I) generando un bloqueo de la esteroidogénesis, ovogénesis y espermatogénesis en distintas especies animales.

Comentarios de la técnica anterior

Las capacidades reproductivas de ambos sexos en la mayoría de las especies animales sufren fluctuaciones cíclicas temporales gracias a los efectos que generan las hormonas sexuales sobre las gónadas y el sistema reproductor en general. La hormona liberadora de gonadotropina o GnRH desempeña un papel central en este proceso.

La hormona GnRH-I es un decapéptido que posee una secuencia de aminoácidos evolutivamente muy conservada y común para la mayoría de los mamíferos. La GnRH-I se libera desde la porción mesiobasal del hipotálamo y entra 20 en el torrente sanguíneo, donde en la hipófisis induce la liberación de LH y FSH desde células gonadotrofas. Durante varios años se ha tratado de generar inmunoneutralización de la hormona GnRH-1 como control de la esteroidogénesis, ovogénesis y espermatogénesis. El bloqueo de GnRH y la concomitante disminución en los niveles de gonadotrofinas tiene variadas aplicaciones, es así que en medicina humana la disminución en la producción de andrógenos de pacientes con carcinoma prostático ha sido blanco de tratamiento durante varios años. 25 Por otro lado, en medicina veterinaria el bloqueo de la capacidad reproductiva con mínimos efectos secundarios de animales de compañía o especies silvestres que puedan significar plagas ha sido un amplio tema de investigación y desarrollo. En el ámbito de la producción animal, la castración quirúrgica de machos es un procedimiento rutinario para evitar un comportamiento sexual agresivo o evitar que la carne adquiera características organolépticas indeseables por el efecto de las feromonas. En todos estos escenarios, la utilización de una vacuna capaz de bloquear la función de la hormona GnRH-I constituye una importante herramienta.

El efecto de diferentes vacunas contra la hormona GnRH se ha evaluado en un gran número de especies animales, utilizando un variado tipo de moléculas asociadas a la GnRH junto con distintos tipos de adyuvantes. La mayoría de éstos enfoques se basan en la síntesis química de haptenos uniendo GnRH a una molécula altamente inmunogénica como albúmina bovina (BSA) , ovoalbúmina (OVA) , toxoide tetánico (TT) o hemocianina (KLH) (Sad, Chauhan et al. 35 1993; Beekman, Schaaper et al. 1999; Dunshea, Colantoni et al. 2001; Miller, Gionfriddo et al. 2008) . Sin embargo, un fenómeno de dominancia antigénica se ha descrito, en la que estas proteínas "vehículo" suprimen la respuesta hacia epítopos de la molécula de interés luego de sucesivas inmunizaciones, en un mecanismo de tolerancia al antígeno GnRH (Sad, Gupta et al. 1991; Sad, Gupta et al. 1991; Sad, Talwar et al. 1991) . La supresión de epítopos puede ser resultado de un defecto en la presentación del hapteno por linfocitos B específicos desarrollando una respuesta inmunitaria de tipo "colaboradora" 2 (Th2) (Renjifo, WoIf et al. 1998) . La exclusión de epítopos con alta antigenicidad, como ha sido planteado en La presente invención, reduce el riesgo de supresión antigénica y favorece una respuesta inmunitaria a favor del antígeno GnRH, lo que permite su utilización en repetidas inmunizaciones eficientemente. Otros impedimentos al utilizar el modelo de proteínas "vehículo", es el alto costo en síntesis y conjugación de los antígenos.

La tecnología de ADN recombinante ha sido usada para crear moléculas de GnRH repetidas en tándem, unidas a diferentes secuencias proteicas como inmunógenos para linfocitos T colaboradores (Hannesdottir, Han et al. 2004; Jinshu, Jingjing et al. 2004; Khan, Ferro et al. 2007; Zhang, Xu et al. 2007; Khan, Ogita et al. 2008) . Proteínas recombinantes con múltiples insertos de GnRH han demostrado que la inmunogenicidad se ve incrementada con el numero de secuencias GnRH insertadas [15], y puede utilizar esta ventaja al incorporar un mayor número de 50 repeticiones del péptido de fusión en la formulación. Múltiples epítopos de células B o T como lipopéptidos (Pam3Cys) o diferentes secuencias peptídicas de patógenos como Plasmodium falciparum, Mycobacterium, virus respiratorio sincitial o virus influenza, flanqueando secuencias de GnRH han sido utilizados en variados modelos "vacunales" y han demostrado efectividad (Khan, Ferro et al. 2007) . En relación a esto, el presente antígeno no incorpora secuencias de patógenos que puedan interferir en el desencadenamiento de una respuesta inmunitaria contra la secuencia de GnRH, ya que la secuencia intergénica utilizada entre las repeticiones de GnRH se ha diseñado para mejorar la antigenicidad de la secuencia de GnRH.

En este sentido, el documento US 2005/0239701 Al está dirigido al uso como vacuna de multímeros de GnRH unidos a proteínas "vehículo" o fragmentos de ellas como toxinas bacterianas, y al uso de vectores recombinantes que incorporan secuencias genéticas que codifican para multímeros de GnRH, solos o en combinación con secuencias genéticas que codifican proteínas "vehículo" tales como el fragmento de toxina tetánica C. Dichos vectores recombinantes están dirigidos a modificar la conducta sexual, la fertilidad o ambos, en vertebrados por medio de la inducción de una respuesta inmunitaria que altera la función sexual fisiológica normal. La presente invención no incorpora secuencias génicas o peptídicas de proteínas "vehículo", ni tampoco corresponde a multímeros de GnRH solos, ya que incorpora una secuencia intergénica no asociada a patógenos o proteínas "vehículo" que funciona mejorando la inmunogenicidad de GnRH como antígeno, además esta secuencia posee la potencialidad de ser glicosilada cuando la proteína recombinante se expresa en sistemas eucariotas capaces de realizar modificaciones post-traduccionales a las proteínas.

La publicación internacional WO 01/85763 divulga péptidos quiméricos con eficacia inmunogénica que comprenden la secuencia de la hormona GnRH y mezclas de epítopos para células T "colaboradoras" obtenidos desde diferentes patógenos o péptidos con inmunogenicidad conocida como la toxina tetánica, Plasmodium falciparum, o la proteína F del virus del Sarampión, para la producción de títulos de anticuerpos anti-GnRH.

En general, la mayoría de las publicaciones en que se divulga la utilización de proteínas de fusión, el método se enfoca a la utilización de secuencias de patógenos que funcionan como epítopos de linfocito T-“Colaborador”, unidos a distinto número de repeticiones de GnRH o como en el caso de una síntesis química las repeticiones de GnRH unidas a una molécula inmunogénica per se. Ejemplo de esto es el documento "Use of recombinant gonadotropinareleasing hormone antigens for immunosterilizacion of beef heifers", Journal of Animal Science, 2006; 84 (2) : 343-50, Gear y TW, Grings EE, MacNeil MD, de Avila DM, Reeves JJ.

Un gran número de estudios se han realizado en cerdos y ganado para investigar el uso de la inmunización contra GnRH como método para mejorar la tasa de crecimiento y el producto cárneo obtenido de los animales. Ver por ejemplo, Adams and Adams, J. Animal Sci. (1992) 70:1691-1698; Caray and Bonneau, CR. Acad. Sc. Paris (1986) 303:673-676; Chaffaux et al, Recueil de Medicine Veterinaire (1985) 161:133-145; Finnerty et al., J. Repro. Fértil. (1994) 101:133-343. La castración elimina la fuente de esteroides anabólicos endógenos y la conversión alimenticia se torna menos eficiente, los animales necesitan comer más para generar canales del mismo peso y producen mayor cobertura grasa. En este sentido, se ha demostrado que el crecimiento de un animal entero es más eficiente que el de un animal castrado. La presencia de esteroides sexuales en el animal actúan como anabólicos naturales, permitiendo que este animal tenga un mejor desempeño en crecimiento y desarrollo muscular, gracias... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión, en la que dicha proteína comprende (i) la secuencia de aminoácidos primaria de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) como se define mediante Gln-His-Trp-ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly fusionada a (ii) una secuencia con capacidad inmunogénica que contiene sitios de O-glicosilación y definida por Gly

Pro-Pro-Phe-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Pro-Phe-Ser-Ala, en la que dicha proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 1 y 2 o una o más repeticiones de la misma.

2. Una proteína de fusión acuerdo a la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión comprende la SEC Nº 7.

3. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicha proteína de fusión comprende la secuencia señal SGGG, correspondiente a un sitio de O-glicosilación, capaz de recibir la 10 modificación postraduccional cuando la proteína se expresa en levaduras u otras células eucariotas.

4. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína de fusión es una proteína de fusión quimérica o recombinante, en la que la secuencia de aminoácidos de GnRH corresponde al 40% de la molécula total y la secuencia que contiene un sitio de O-glicosilación corresponde al 60% de la molécula total.

5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

6. La secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 8-13.

7. Una vacuna veterinaria, en la que dicha vacuna comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera

de las reivindicaciones 1 a 4 o secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6 y 20 uno o más adyuvantes veterinariamente aceptables.

8. La vacuna veterinaria de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha vacuna comprende entr.

5. 500 μg de la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1.

9. La vacuna veterinaria de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dicha vacuna comprende entr.

10. 200 μg de la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1.

10. La vacuna veterinaria de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha vacuna comprende 100 μg de la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1.

11. La vacuna veterinaria de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha vacuna comprende 200 μg de la proteína de fusión recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Una vacuna veterinaria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11 para su uso en 30 inmunocastración animal.

13. Procedimiento de producción de una vacuna veterinaria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que dicho procedimiento comprende mezclar la proteína de la reivindicación 1 o secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 con uno o más adyuvantes veterinariamente aceptables.

14. Procedimiento de preparación de una proteína de fusión de acuerdo con un cualquiera de las reivindicaciones 1

a 3, en el que dicho procedimiento comprende fusionar la secuencia de aminoácidos de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-I) definida por Gly-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly con una secuencia que contiene sitios de O-glicosilación que tienen actividad inmunogénica y que consiste en la secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Pro-Phe-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Pro-Phe-Ser-Ala para obtener una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 1 y 2 o una o más repeticiones de la misma.