Procedimiento para preparar exenatide que comprende:

a) proporcionar aminoácidos,

protegidos o no protegidos, unidos en su C terminal a una resina lábil superácida;

b) acoplar dicho aminoácido con otro aminoácido, protegido o no protegido, en presencia de un reactivo de acoplamiento;

c) repetir la etapa b) para obtener un péptido, en el que el péptido está protegido con por lo menos un grupo protector que permanece en el péptido cuando se escinde la resina;

d) escindir dicho péptido protegido de la resina mezclando con una solución ácida moderada; y

e) realizar la amidación del péptido protegido obtenido en la etapa d), con una amina apropiada

Procedimientos para la producción de un péptido que presenta una amida C-terminal.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un péptido que es un derivado de amida C-terminal y a sus productos.

Antecedentes de la invención

La síntesis peptídica puede consistir en una síntesis en fase sólida (SPPS) o en una síntesis en fase de solución y generalmente se lleva a cabo desde el extremo C al extremo N. Existen diversos grupos de péptidos y de compuestos peptidomiméticos caracterizados por la derivación en el extremo carboxilo de la cadena peptídica.

La síntesis de los péptidos derivados se lleva a cabo generalmente mediante una síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) o una síntesis en fase de solución. La SPPS implica habitualmente la utilización de una resina sobre la cual se construye el péptido derivado. La síntesis en fase de solución se basa habitualmente en la condensación de fragmentos.

La SPPS se describe en BE 841180 y la patente US nº 4.002.738. Mediante este procedimiento, la prolina que transporta como grupo bloqueador el sustituyente t-butiloxi-carbonilo (Boc-) sobre el grupo amino, es esterificada mediante combinación con un copolímero estireno-divinilbenceno clorometilado (resina Merrifield), utilizando el procedimiento descrito por Stewart et al, en "SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS" (publicado por Freeman & Company en 1969). La síntesis continúa secuencialmente en un sintetizador automático, aplicando la química Boc para la síntesis del nonapéptido deseado. La desprotección del grupo Boc se realizó por el 4N ácido clorhídrico/dioxano. La conjugación se llevó a cabo utilizando diciclohexilcarbodiimida en diclorometano con un exceso de 2,9 veces. Finalmente, la resina peptídica obtenida por este procedimiento se suspendió en 200 ml de trietilamina/metanol al 5%, añadiéndose 100 ml de etilamina destilada. Después de 24 horas, la resina fue eliminada mediante filtración, evaporándose la solución para obtener un sólido. Éste se disolvió en ácido acético glacial y se purificó en una columna de gel de sílice para obtener un nonapéptido tri-protegido (con grupos protectores de Ser, Tyr y Arg). La desprotección final se llevó a cabo mediante fluoruro de hidrógeno anhidro. El producto en bruto se purificó finalmente mediante cromatografía en una columna Sephadex G-25 (comercializada por Pharmacia Uppsala, Suecia).

Otro ejemplo de SPPS se encuentra en la patente US nº 4.005.063.

En general, los péptidos pueden prepararse utilizando la SPPS que se describe por Merrifield en J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963). Más particularmente, la prolina N-bloqueada es esterificada a un copolímero estireno-divinilbenceno-clorometilado, después del desbloqueo, la arginina N?-bloqueada que transporta un grupo protector lábil sobre N-imino se conjuga con el grupo imino, ahora libre, del éster de la prolina y, después del desbloqueo, esta secuencia de fases de conjugación y desbloqueo se repite con otros aminoácidos en la secuencia del péptido deseado. Todos los aminoácidos se utilizan en su forma L, excepto para el aminoácido identificado como D-aminoácido en la fórmula. Después de que todos estos aminoácidos se unen en la secuencia mencionada anteriormente con los grupos protectores que transportan la arginina, tirosina, serina y opcionalmente, histidina, el nonapéptido es eliminado de la resina mediante transesterificación/amonolisis, por lo que el enlace resínico es reemplazado por el extremo etilamida. El tratamiento siguiente, de forma conocida, elimina todos los grupos protectores, dando lugar al péptido en forma sustancialmente pura y con un rendimiento aceptable.

La solicitud de patente europea EP 0 518 656 A2 describe una SPPS de la secuencia Goserelin sobre una resina mediante un ligamento que es lábil a la hidrazina. La escisión del péptido a partir de la resina da lugar al derivado de la hidrazina, que puede convertirse en el residuo aza-Gly terminal. La protección de las cadenas laterales se obtiene utilizando los siguientes grupos protectores: BrZ para Tyr, Fmoc para His, y tBu para D-Ser en la posición 6, evitando la protección del Ser en la posición 4.

Otra solicitud de patente europea, EP 0 518 655 A2, describe una SPPS que empieza con una resina precargada con la unidad de construcción AzaGly. No se utilizó protección para las cadenas laterales de Ser y Tyr de la posición 4. El péptido final se trató con hidrazina para hidrolizar posibles productos laterales con cadenas laterales aminoácidas aciladas que se incorporan en forma libre.

La solicitud de patente europea EP 1 179 537, describe una SPPS de una secuencia peptídica que se prepara secuencialmente utilizando super grupos protectores lábiles superácidos y otro tipo de super resinas ácido lábiles, de tal forma que el péptido pudo eliminarse a partir de la resina, mientras se mantuvieron los grupos protectores de la cadena lateral, que pueden eliminarse después mediante otro tratamiento ácido. El grupo C-terminal tal como aza-glicina o etilamina se une a la cadena peptídica protegida mediante un procedimiento regular de formación amídica. La principal desventaja de este procedimiento es la necesidad de aplicar estrategias de protección caras y únicas.

Otra metodología es una síntesis en fase de solución, basada en la condensación de fragmentos, tal como se describe mediante la publicación de la patente internacional WO 99/07874. Mediante este procedimiento, el péptido requerido puede obtenerse haciendo reaccionar un fragmento peptídico representado por la fórmula general siguiente pGlu-His-Trp-OR₁ (en la que R₁ representa un grupo alquilo inferior) con otro fragmento peptídico representado por la fórmula general: H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y, en presencia de quimiotripsina o una enzima tipo quimotripsina.

Otra variación en el procedimiento de condensación de los fragmentos se da a conocer en la patente US nº 4.008.209. En esta patente, se produce un derivado de amida nonapeptídico mediante un procedimiento en el que un reactivo (A)- ácido L-piroglutámico o un fragmento peptídico que tiene una unidad de ácido L-piroglutámico (es decir, (Pyr)Glu) en su extremo N-terminal, y que al mismo tiempo, comprende la secuencia aminoácida deseada -se condensa con un reactivo (B)- un componente amínico que corresponde al equilibrio del derivado amídico nonapéptido-, estando los dos reactivos (A) y (B) protegidos opcionalmente mediante un grupo o grupos protectores, y entonces, el grupo o grupos protectores, si existe alguno, son eliminados.

En otro ejemplo del mismo enfoque sintético en la fase de solución (solicitud de patente rusa RU 2074191), la síntesis se lleva a cabo según un esquema de fragmentación 2+ (2+(4+1)], aplicando la química Cbz y un residuo Arg desprotegido de cadena lateral.

En otro ejemplo (publicación de patente internacional WO 97/48726), la cadena peptídica se construye mediante una estrategia 2+4+3 de acoplamiento de fragmentos. Se aplica la química Cbz de protección y uno de los productos intermedios se purifica mediante cristalización, mientras que el péptido final se purifica mediante cromatografía de intercambio iónico.

La patente US nº 4.100.274 describe un procedimiento para obtener Goserelin mediante la condensación de tres fragmentos preformados que contienen -NO₂ como grupo protector para la arginina y -Bzl como grupo protector para la tirosina, los dos cuales son lábiles a la hidrogenólisis. En este procedimiento, el residuo azaglicina se introduce en el tripéptido C-terminal, que se une entonces a Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-N_3, para dar lugar a un fragmento que, una vez se elimina el grupo Z, se une a Pyr-His-Trp-Ser-N₃ para dar lugar a Goserelin. Esta última reacción se lleva a cabo con la totalidad de las cadenas laterales no protegidas, con la excepción de la que pertenece a D-Ser (tBu).

Sumario de la invención

En una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar exenatide, que comprende: proporcionar aminoácidos, protegidos o no, unidos en su C terminal a una resina lábil superácida, protegida o no, en presencia de un reactivo de unión; repetir la etapa de unión para obtener un péptido, en la que el péptido está protegido con por lo menos un grupo protector que permanece en el péptido después de su escisión de la resina; escisión de dicho péptido protegido de la resina, mezclándolo con una solución ácida moderada; y amidando el péptido protegido...

1. Procedimiento para preparar exenatide que comprende:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la amidación en la etapa e) se lleva a cabo en presencia de una base, preferentemente la diisopropiletilamina.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la resina lábil superácida se selecciona de entre el grupo constituido por: resina clorotritilo, resina ácida Rink, resina NovaSyn TGT, y resina HMPB-AM.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo de acoplamiento es el tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio (TB-TU).

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución ligeramente ácida en la etapa d) es una solución que comprende aproximadamente 0,1% y aproximadamente 5% de TFA en un disolvente orgánico inerte o una mezcla de ácido acético con trifluoroetanol y DCM.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido protegido con la resina obtenida en la etapa d) se aísla antes de la etapa e).

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el aislamiento es mediante precipitación, cristalización, extracción, o cromatografía, siendo preferentemente el aislamiento mediante precipitación.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el péptido protegido obtenido después de la escisión de la resina, es un precursor de exenatide protegido, constituido por aminoácidos que presenta la secuencia de Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu-(tBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asp(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser-(tBu)- Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-OH (SEC. ID. nº31).

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la amidación comprende el tratamiento de un precursor de exenatide protegido con un reactivo de acoplamiento en presencia de amoníaco en DMF, para obtener un precursor de exenatide protegido constituido por aminoácidos que presenta la secuencia Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asp(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH₂ (SEC. ID. nº:31).

10. Procedimiento según la reivindicación 9, que comprende además después de la amidación, la reacción del exenatide protegido con una composición ácida que comprende una solución de TFA que contiene agua, TlS y EDT: añadir éter para obtener un precipitado de exenatide constituido por aminoácidos que presentan la secuencia de: H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂ (SEC ID nº:31) y aislar el exenatide.

11. Procedimiento para preparar acetato de exenatide que comprende obtener exenatide según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y convertir el exenatide obtenido en acetato de exenatide.

12. Composición farmacéutica que comprende acetato de exenatide preparado según la reivindicación 11 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Acetato de exenatide que presenta una pureza de por lo menos aproximadamente 99,0%, como se ha determinado mediante el procedimiento HPLC.