Membranas víricas reconstituidas funcionalmente que contienen adyuvante.

Membrana vírica reconstituida para su uso farmacéutico mediante administración intranasal,

comprendiendo su bicapa lipídica una proteína de fusión de un virus, un adyuvante anfifílico y, opcionalmente, un antígeno adicional, en el que:

(a) la bicapa lipídica presenta una composición de lípidos que es compatible con la fusión, inducida por la proteína de fusión, de la membrana vírica con la membrana de una célula que puede fusionarse con el virus a partir del cual se ha derivado la proteína de fusión,

(b) la proteína de fusión y el adyuvante anfifílico interactúan con el interior hidrófobo de la bicapa lipídica; y

(c) la proteína de fusión, el adyuvante anfifílico y el antígeno adicional opcional no se encuentran unidos covalentemente,

en la que el adyuvante anfifílico es un lipopéptido que es un ligando para un receptor de tipo Toll de mamífero.

Membranas víricas reconstituidas funcionalmente que contienen adyuvante.

Campo de la invención La presente invención se refiere a vacunas dirigidas contra antígenos tales como proteínas membranarias procedentes de patógenos o células tumorales. La invención se refiere además a métodos para formar membranas víricas reconstituidas, con actividad de fusión de membranas, que son membranas de bicapa lipídica que contienen los lípidos naturales de un virus, antígenos anfifílicos, así como adyuvantes anfifílicos, y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas membranas víricas reconstituidas.

Antecedentes de la invención Clásicamente, las vacunas contra virus con cubierta contienen virus muertos o vivos atenuados, o comprenden una preparación de sus constituyentes (por ejemplo virus fraccionados o preparaciones de subunidades) . Para la vacunación, los virus o proteínas presentes en dichas vacunas son incorporados por células presentadoras de antígeno del sistema inmunitario, tales como células dendríticas o macrófagos, seguido de una presentación de las partes antigénicas de las vacunas a células efectoras del sistema inmunológico. Las vacunas resultan efectivas al ser inyectadas debido a que las células presentadoras de antígeno son más abundantes inmediatamente debajo de la piel. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que también se encuentran presentes células similares en la mucosa que, por ejemplo, revista la nariz (Ogra et al., 2001) . Con el fin de inducir estos fagocitos presentes en la mucosa a construir una respuesta inmunológica, resulta necesaria una estimulación mucho más fuerte que para los presentes bajo la piel (Janeway et al., 2001) .

Aunque la inyección de algunos virus o proteínas contenidos en las vacunas, por ejemplo el virus de la gripe o el virus del sarampión, induce una respuesta inmunológica que es suficientemente fuerte para proteger frente a una infección posterior por el mismo virus, éste no es el caso para muchos otros, por ejemplo el virus sincitial respiratorio. Se han llevado a cabo numerosos esfuerzos para reforzar la respuesta inmunológica por medios físicos o químicos. Los principios más importantes que se desprenden de dichos experimentos son: (1) para la estimulación física deben combinarse en las partículas múltiples copias de las proteínas víricas. Estas partículas pueden ser virus completos, membranas víricas reconstituidas o proteínas sobre portadores micropartícula. Las partículas estimulan el sistema inmunitario mejor que las subunidades individuales (Ogra et al., 2001; Janeway et al., 2001) . (2) La estimulación química, por otra parte, requiere que los fagocitos o las células efectoras del sistema inmunitario reciban determinadas señales a través de receptores presentes sobre la superficie de la célula presentadora de antígeno, por ejemplo mediante la utilización de adyuvantes, que son compuestos químicos que resultan reconocidos por dichos receptores.

Con suficiente estimulación fisicoquímica adicional, las proteínas víricas pueden inducir respuestas inmunológicas fuertes incluso en el caso de que se apliquen en membranas mucosas, por ejemplo tras la aplicación en la nariz (Ogra et al., 2001) . La mayoría de los métodos y composiciones actuales para estimular una respuesta inmunológica por dichos medios, sean químicos o físicos o las combinaciones de los dos principios presentan desventajas significativas que se describen de manera general posteriormente.

Un tipo particular de composición de vacuna que se ha desarrollado en la técnica se conoce como "virosoma", que es una bicapa lipídica que contiene glucoproteínas víricas. Los virosomas pueden comprender membranas víricas reconstituidas, generalmente producidas mediante extracción de proteínas y lípidos membranarios procedentes de virus con cubierta utilizando un detergente, seguido de la adición de lípidos y la eliminación de dicho detergente de las proteínas y lípidos membranarios víricos extraídos, de manera que se forman bicapas lipídicas características con las proteínas sobresaliendo de las mismas (Stegmann et al., 1987) . Los virosomas también pueden comprender membranas formadas a partir de proteínas víricas purificadas y lípidos sintéticos o naturales, u otras sustancias que formarán una bicapa. Un rasgo característico de los virosomas es que imitan estrechamente la composición, arquitectura superficial y actividades funcionales de la cubierta vírica nativa. Una característica particularmente importante de dichos virosomas implica la conservación de la actividad de unión a receptores y de fusión a membranas de la cubierta vírica nativa, permitiendo que los virosomas entren en las mismas células en las que podrían entrar los virus, y ser presentados al sistema inmunitario por estas mismas células. La conservación de las actividades de unión a receptor y de fusión a membranas resultan esenciales para la expresión de las propiedades inmunogénicas completas de dichos virosomas (Arkema, 2000; Bungener, 2002) .

Para algunos antígenos víricos, los virosomas inducen respuestas inmunológicas protectoras que pueden ser fuertes incluso en el caso de que la vacuna se administre, por ejemplo, por vía intranasal (tal como se ejemplifica en los documentos WO 88/08718 y 92/19267) . Sin embargo, otras formulaciones de virosoma muestran únicamente una inmunogenicidad marginalmente mejorada comparado con virus muertos o preparaciones de subunidades (tal como se ejemplifica en Glück et al., 1994) . En dicho ejemplo citado, los virosomas se generaron mediante un protocolo que incluía la adición de lípidos exógenos, que se ha descubierto que resultan en una composición de los virosomas y una arquitectura superficial diferente de las presentes en la cubierta vírica nativa. Es conocido por el experto en la

materia que esta diferente arquitectura superficial podría afectar a las propiedades de fusión a membrana de los virosomas producidos y, de esta manera, a su inmunogenicidad.

Para incrementar la respuesta inmunológica, permitiendo la aplicación intranasal de dicha vacuna, se mezcló una proteína adyuvante de Escherichia coli (toxina termolábil) con la vacuna del virus de la gripe de virosoma suplementado con lípido (documento EP 0 538 437) . Los ensayos clínicos indican que la adición de la toxina resulta absolutamente necesaria para inducir títulos séricos de anticuerpos equivalentes a los inducidos por la vacuna inyectada (Glück et al., 1994) . Aunque de esta manera la adición de la toxina efectivamente incrementa la inmunogenicidad de la vacuna, también induce un efecto secundario grave conocido como parálisis de Bell, una parálisis temporal de los músculos faciales. Debido a que el efecto adyuvante de la toxina se debe al reconocimiento por parte de una célula presentadora de antígenos, no existe la certeza en este caso de que la toxina y la proteína vírica entren en contacto con la misma célula y por lo tanto que resulte necesaria una concentración relativamente alta de toxina para garantizar la activación de todas las células, incrementando la probabilidad de que los antígenos serán reconocidos por una célula activada. Por lo tanto, este tipo de preparación de virosoma con lípidos añadidos presenta bastantes desventajas.

También se han preparado virosomas a partir de antígenos Influenza purificados, mezclados con derivados de dipéptido muramilo (documentos EP 0 205 098 y 0 487 909) . En este caso, el derivado dipéptido muramilo forma la membrana. Aunque el dipéptido muramilo es un adyuvante y la formulación en efecto se ha encontrado que incrementa la respuesta inmunológica a los antígenos Influenza, los dipéptidos muramilo son pirogénicos (Kotani et al., 1976; Dinarello et al., 1978) , son rápidamente eliminados del cuerpo tras la inyección y presentan toxicidad local, conduciendo a la formación de granulomas e inflamación (Ribi et al., 1979; Kohashi et al., 1980) . Además, presentan una vida útil limitada a pH neutro (Powell et al., 1988) y el pH óptimo para mantener su integridad estructural es excesivamente bajo para permitir su formulación en una vacuna conjuntamente con una proteína de fusión de virus que entran en las células mediante endocitosis mediada por receptores, tales como la hemaglutinina del virus de la gripe. Además, dichas membranas sintéticas no mimetizan bien la membrana vírica natural y, de esta manera, la respuesta inmunológica frente a ellas diferirá de la generada contra el virus.

Alternativamente, los investigadores en la materia también han generado antígenos acomplejados diferentes de las membranas víricas reconstituidas, tales como los "complejos inmunoestimuladores" (los ISCOM, Morein et al., 1984) , que contienen proteínas... [Seguir leyendo]

1. Membrana vírica reconstituida para su uso farmacéutico mediante administración intranasal, comprendiendo su bicapa lipídica una proteína de fusión de un virus, un adyuvante anfifílico y, opcionalmente, un antígeno adicional, en 5 el que:

(a) la bicapa lipídica presenta una composición de lípidos que es compatible con la fusión, inducida por la proteína de fusión, de la membrana vírica con la membrana de una célula que puede fusionarse con el virus a partir del cual se ha derivado la proteína de fusión,

(b) la proteína de fusión y el adyuvante anfifílico interactúan con el interior hidrófobo de la bicapa lipídica; y

(c) la proteína de fusión, el adyuvante anfifílico y el antígeno adicional opcional no se encuentran unidos covalentemente,

en la que el adyuvante anfifílico es un lipopéptido que es un ligando para un receptor de tipo Toll de mamífero.

2. Membrana vírica reconstituida según la reivindicación 1 para su uso farmacéutico para la protección profiláctica contra patógenos, para el tratamiento de enfermedades tras una infección patogénica o para el tratamiento de un 20 tumor.

3. Membrana vírica reconstituida según la reivindicación 1 o 2, en la que la bicapa lipídica comprende lípidos naturales de una membrana vírica.

4. Membrana vírica reconstituida según la reivindicación 3, en la que el lipopéptido es seleccionado de entre el grupo constituido por N-palmitoil-S-2, 3 (bispalmitoiloxi) -propil-cisteinil-seril-serina, S-2, 3 (bispalmitoiloxi) -propilcisteinil-seril-serina, N-palmitoil-S-2, 3 (bispalmitoiloxi) -propil-cisteinil-seril- (lisil) 3-lisina, S-2, 3 (bispalmitoiloxi) -propilcisteinil-seril- (lisil) 3-lisina, N-palmitoil-S-2, 3 (bisoleoiloxi) -propil-cisteinil-seril (lisil) 3-lisina, S-2, 3 (bisoleoiloxi) -propilcisteinil-seril-serina (lisil) 3-lisina, N-palmitoil-S-2, 3 (bismiristoiloxi) -propil-cisteinil-seril- (lisil) 3-lisina, S

2, 3 (bismiristoiloxi) -propil-cisteinil-seril- (lisil) 3-lisina, N-palmitoil-S-3 (palmitoiloxi) -propil-cisteinil-seril- (lisil) 3-lisina, y Npalmitoil-S-2, 3-hidroxi-propil-cisteinil-seril- (lisil) 3-lisina, N-palmitoil-S-2, 3 (bispalmitoiloxi) -propil-cisteinil-seril- (prolil) 3prolina, ácido N-palmitoil-S-2, 3 (bispalmitoiloxi) -propil-cisteinil-seril- (glutaminil) 3-glutamínico.

5. Membrana vírica reconstituida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antígeno adicional es 35 una proteína membranaria integral.

6. Membrana vírica reconstituida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno es un antígeno vírico.

7. Membrana vírica reconstituida según la reivindicación 4, en la que el antígeno procede de un virus de la gripe.

8. Membrana vírica reconstituida según la reivindicación 7, en la que el antígeno es una hemaglutinina (HA) , una neuraminidasa (NA) o una proteína M2.

9. Membrana vírica reconstituida según la reivindicación 6, en la que el antígeno se deriva de un virus seleccionado de entre el grupo constituido por Retroviridae, virus de la rubeola, Paramyxoviridae, Flaviviridae, Herpesviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Hantaviridae, Coronaviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae, Coronaviridae, Alphaviridae, Arteriviridae, Filoviridae, Arenaviridae, poxviridae y virus de la fiebre porcina africana.

10. Membrana vírica reconstituida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antígeno se deriva de un parásito, una bacteria, un hongo, levadura, o en la que el antígeno es un antígeno específico tumoral.