Marcadores para células pre-cancerígenas y cancerígenas y el método para interferir con la proliferación celular en ellas.

Una molécula de ARN quimérico mitocondrial aislada que comprende ARN ribosómico mitocondrial 16S sentido covalentemente ligado en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleótido con una secuencia de repetición invertida,

en la que la molécula de ARN quimérica comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 3.

Marcadores para células pre-cancerígenas y cancerígenas y el método para interferir con la proliferación celular en ellas

Campo de la invención

La invención se refiere a terapia contra el cáncer y a reactivos de investigación a propósito de una novedosa familia de ARN mitocondriales humanos denominados ARN quiméricos mitocondriales humanos. En particular, la presente invención se refiere a oligonucleótidos dirigidos a los ARN quiméricos mitocondriales humanos. Los oligonucleótidos de la invención se hibridan con los ARN quiméricos que inducen la muerte de células cancerígenas. La composición y métodos proporcionados en la invención son útiles como una nueva terapia contra el cáncer.

Antecedentes de la invención

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que fabrican la molécula esencial adenosina trifosfato (ATP) por fosforilación oxidativa. El ADN mitocondrial humano (ADNmt) de 16.654 pares de bases codifica dos ARN ribosómicos, 22 ARN de transferencia (ARNt) y 13 marcos de lectura abiertos (ORF) que codifican un número similar de polipéptidos (Clayton, Hum Reprod., Suppl. 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999). Basándose en el contenido de la composición de bases G+T, las dos hebras del ADNmt se diferencian en la densidad de flotación y pueden separarse en gradientes de cloruro de cesio desnaturalizantes. La hebra pesada o hebra H codifica los dos ARN ribosómicos (12S y 16S), 14 ARNt y 12 polipéptidos correspondientes a ND 1, ND 2, ND 3, ND4L, ND4, ND 5, COXI, COX II, COX III, ATP6, ATP8 y Cyt b. La hebra ligera o hebra L codifica 8 ARNt y la subunidad del complejo NAD deshidrogenasa ND6 (Clayton, Hum Reprod., Suppl. 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999).

Una gran proporción del ADNmt contiene una estructura de tres hebras cortas llamada el bucle de desplazamiento o bucle D. Esta región, que en seres humanos tiene 1.006 pares de bases, está flanqueada por los genes para ARNt de fenilalanina (ARNtPhe) y el ARNt de prolina (ARNtPro) y contiene una hebra de ácido nucleico corta complementaria a la hebra L y que desplaza la hebra H (Clayton, Hum Reprod., Suppl. 2:11 -17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999). Esta región se ha desarrollado como el principal sitio de control para la expresión del ADNmt y contiene el origen de replicación de hebra conductora o hebra H y los principales promotores para la transcripción de la hebra H (HSP) y L (LSP). A pesar de la estrecha proximidad de HSP y LSP (aproximadamente 150 pb), estos elementos reguladores son funcionalmente independientes in vitro (Shuey y Attardi, J. Biol. Chem., 260:1952-1958, 1985; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999), además de in vivo, utilizando pacientes modelo con enfermedades mitocondriales (Chinnery y Tumbull, Mol. Med. Today, 6:425432, 2000).

Ambas hebras se transcriben como ARN policistrónicos que luego se procesan para liberar los ARNm individuales, ARNt y los ARNr (Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999). En seres humanos, la ARN polimerasa mitocondrial es una proteína de 1.230 aminoácidos con homología significativa con la secuencia de ARN polimerasa mitocondrial de levadura y con las ARN polimerasas de varios bacteriófagos (Tiranti et al., Hum Mol Genet., 6:615- 625, 1997). Además, se ha caracterizado una familia de factores de transcripción tal como el factor de transcripción mitocondrial A o TFAM que es esencial para la transcripción de ADNmt de mamífero y es un miembro de la familia de la caja del grupo de alta movilidad (HMG) de proteínas de unión a ADN (Paris) y Clayton, Science, 252:965-969, 1991). Recientemente, dos informes independientes describieron las características de los nuevos factores de transcripción, TFB1M y TFB2M, en ser humano y ratón (McCulloch et al., Mol. Cell Biol., 22, 1116-1125, 2002; Falkenberg et al., Nat. Genet., 31:289-294, 2002; Rantanen et al., Mamm. Genome, 14:1-6, 2003). A pesar del considerable progreso logrado en los elementos que actúan en cis y trans que participan en la transcripción de ADNmt, no se entienden completamente los detalles funcionales.

Mitocondrias y apoptosis

Las mitocondrias desempeñan una función central en la apoptosis, un proceso biológico fundamental por el que las células mueren de una manera controlada o programada. Este programa suicida de células es esencial durante el desarrollo y para la homeostasis adulta de todos los animales metazoos. La apoptosis se activa para erradicar células superfluas, dañadas, mutadas y envejecidas (Meter et al., Nature, 407:796-801, 2000). La desregulación de la apoptosis participa en la aparición de varias patologías. Así, la inhibición anormal de la apoptosis es un distintivo de neoplasia, mientras que la apoptosis masiva se ha ligado a enfermedades agudas tales como accidente cerebrovascular, choque séptico y trastornos neurodegenerativos. Actualmente, el proceso de apoptosis se describe como dos rutas importantes conocidas como las rutas extrínsecas e intrínsecas (Zomig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001). La ruta extrínseca es un proceso que se inicia en la membrana celular por la unión de diferentes ligandos a los receptores de muerte (Krammer, Nature, 407:789-795, 2000; Zomig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-f37, 2001).

Las caspasas son responsables de la cascada proteolítica en la apoptosis. Las caspasas se sintetizan como

proteínas precursoras inactivas que experimentan maduración proteolítica o procesamiento tras la inducción de la apoptosis (Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551 :F1 - F37, 2001). Sin embargo, más recientemente, varios estudios experimentales indican que las proteasas lisosómicas constituyen una ruta de proteólisis alternativa después de las lesiones apoptósicas (Guicciardi et al., Oncogene, 23:2881-2890, 2004). Por otra parte, se han descrito proteínas antiapoptósicas homologas a la oncoproteína Bcl-2 humana. Esta proteína pertenece a una familia de proteínas que son tanto antiapoptósicas (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w) como pro-apoptósicas (Bax, Bak, Bim, Bid, etc.) (Zorning etal., Biochim. Biophys. Acta, 1551 :F1-F37, 2001).

Las mitocondrias se afectan particularmente pronto durante el proceso apoptósico y actualmente son reconocidas como los coordinadores centrales de la muerte celular (Boya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 304:575-581, 2003; Ferri y Kroemer, Nature Cell Biol., 3:E255-E263, 2001; Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001). Varias rutas de señalización y daño pro-apoptósicas convergen sobre las mitocondrias para inducir la permeabilización de la membrana mitocondrial, un fenómeno que está bajo el control de las proteínas Bcl-2 (Boya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 304:575-581, 2003; Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001). Después de que las células reciban ataques apoptósicos, el potencial transmembrana (A,pm) se disipa produciendo la permeabilización completa de la membrana mitocondrial externa y la consecuente fuga de proteínas intermembrana mitocondriales tóxicas. El primer ejemplo de la fuga de una proteína mitocondrial fue la liberación de citocromo c (Liu et al., Apoptosis, 6:453-462, 2001). Cuando el citocromo c está presente en el citosol, conduce al ensamblaje del complejo de activación de caspasas llamado el apoptosoma. El citocromo c se une a Apaf-1 (factor de activación de proteasas apoptósicas-1), facilitando la unión de dATP/ATP al complejo y la oligomerización de Apaf-1 (Adrain et al., J. Biol. Chem., 274:20855-20860, 1999; Benedict et al., J. Biol. Chem., 275:8461-8468, 2000). La oligomerización de Apaf-1 permite el reclutamiento de pro-caspasa-9, que cataliza la activación proteolítica del precursor y la generación de caspasa-9 activa (Adrain et al., J. Biol. Chem., 274:20855-20860, 1999; Benedict et al., J. Biol. Chem., 275:8461-8468, 2000).

Se ha descrito una familia del inhibidor citosólico de las proteínas de la apoptosis y se conoce como XIAP, C-IAP1 y C-IAP2. Estas proteínas se unen a e inhiben la caspasa-3 y caspasa-9 procesadas y, por consiguiente, detienen la cascada de degradación. Sin embargo, la célula también contiene mecanismos de contraminado para eludir esta ruta antiapoptósica. En células que experimentan apoptosis, las caspasas son liberadas de este efecto inhibidor uniéndose a IAP de una proteína conocida como Smac (segundo activador mitocondrial de caspasas) o DIABLO (proteína de unión a IAP directa con bajo pl) (Verhagen et al., Apoptosis, 7:163-166, 2002). Uniéndose a IAP, Smac/DIABLO desplazan caspasas activas de IAP y así promueven la muerte celular. Otra proteína, conocida como HtrA2, es liberada de las mitocondrias en el citosol después del ataque apoptósico en el que... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ARN quimérico mitocondrial aislada que comprende ARN ribosómico mitocondrial 16S sentido covalentemente ligado en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleótido con una secuencia de repetición invertida, en la que la molécula de ARN quimérica comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 3.

2. Uno o más compuestos u oligonucleótidos de 10 a 50 nucleobases de longitud para su uso en el tratamiento de cáncer o pre-cáncer, donde dichos uno o más compuestos o oligonucleótidos son suficientemente complementarios a una molécula de ARN quimérico mitocondrial que comprende un ARN ribosómico mitocondrial 16S sentido covalentemente ligado en su extremo 5' a un extremo 3' de un polinucleótido con una secuencia de repetición invertida que es capaz de hibridarse con la molécula de ARN quimérico mitocondrial para formar un dúplex estable.

3. Los compuestos u oligonucleótidos para su uso según la reivindicación 2, en los que los compuestos u oligonucleótidos están seleccionados de SEC ID N°: 98-196.

4. Los compuestos u oligonucleótidos para su uso según la reivindicación 2, en los que los compuestos u oligonucleótidos son oligonucleótidos de 15 a 50 nucleobases de longitud en los que al menos 15 nucleobases son complementarias a SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2 y/o SEC ID N°: 3.

5. Los compuestos u oligonucleótidos para su uso según la reivindicación 4, en los que los compuestos u oligonucleótidos son oligonucleótidos de 18 a 50 nucleobases de longitud.

6. Los compuestos u oligonucleótidos para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en los que los compuestos u oligonucleótidos pueden inducir al menos una muerte de células pre-cancerígenas y muerte de células cancerígenas en células o tejidos.

7. Los compuestos u oligonucleótidos para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en los que los compuestos u oligonucleótidos están adaptados para administración conjuntamente con un fármaco quimioterapéutico para el tratamiento de cáncer.

8. Uso de una molécula de ARN quimérico mitocondrial que comprende un ARN ribosómico mitocondrial 16S sentido covalentemente ligado en su extremo 5' a un extremo 3' de un polinucleótido con una secuencia de repetición invertida como diana que tras la interferencia induce muerte de células cancerígenas y pre-cancerígenas.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que la interferencia se lleva a cabo por un material seleccionado de oligonucleótidos complementarios y ARN interferente pequeño.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho oligonucleótido complementario o ARN interferente pequeño comprende al menos un resto seleccionado del grupo que consiste en: un enlace internucleosídico alternativo, un resto de azúcar modificado y un resto de base modificado.

11. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho oligonucleótido complementario o ARN interferente pequeño comprende uno o más enlaces internucleosídicos alternativos.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que dicho enlace internucleosídico alternativo es un enlace internucleosídico de fosforotioato.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho oligonucleótido complementario o ARN interferente pequeño comprende además uno o más oligonucleótidos del extremo 5' modificados con 2-o-(2-metoxi)etilo y uno o más oligonucleótidos del extremo 3' modificados con 2-o-(2-metoxi)etilo.

14. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho oligonucleótido complementario o ARN interferente pequeño comprende uno o más oligonucleótidos bloqueados o uno o más ácidos nucleicos peptídicos.