Marcador de resistencia a lactona macrocíclica para Dirofilaria immitis.

Un procedimiento de determinación de la capacidad de respuesta de un nematodo Dirofilaria immitis a una lactona macrocíclica,

comprendiendo dicho procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1, en la que el genotipo GG en dichas posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1 indica que es probable que el nematodo sea resistente a dicha lactona macrocíclica.

Marcador de resistencia a lactona macrocíclica para Dirofilaria immitis Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de y prioridad sobre la solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 61/319.982 presentada el 01 de abril de 2010.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la detección de Dirofilaria spp. resistente a lactona macrocíclica.

Antecedentes La dirofilariasis es una enfermedad parasitaria de animales, y en ocasiones de seres humanos, que puede ser el resultado de una infección por una especie de Dirofilaria, tal como D. immitis, D. repens, D. tenuis, D. ursi, D. subdermata, D. lutrae, D. striata y D spectans.

Dirofilaria immitis (gusano del corazón) es un parásito nematodo que normalmente infecta a perros, zorros, lobos, coyotes y gatos. Los gusanos del corazón pueden producir daños vasculares y pueden ser mortales, especialmente en animales altamente activos.

El ciclo de vida de Dirofilaria immitis es bien conocido (revisado en McCall et al., Adv Parasitol. 66:193-285 2008) . En resumen, un mosquito se puede infectar cuando succiona sangre de un huésped infectado (por ejemplo, un perro) . En el mosquito, las microfilarias se desarrollan al estadio de larva infecciosa. Cuando el mosquito infectado se alimenta puede transmitir las larvas a un nuevo huésped (por ejemplo, otro perro) . En el huésped nuevo, las larvas continúan madurando durante de ocho a diez semanas, tras lo cual pasan al lado derecho de los pulmones y a la arteria pulmonar, donde se hacen adultos. Los gusanos adultos se aparean y las hembras producen huevos que se desarrollan dentro del útero en un largo embrión fino (microfilaria) que son liberados a la circulación sanguínea. Un mosquito que captura las microfilarias circulantes cuando extrae sangre del huésped infectado inicia el ciclo de nuevo.

Dirofilaria immitis se puede encontrar donde esté el vector, el mosquito. En general, Dirofilaria immitis se puede encontrar en todo el mundo, pero es muy frecuente en zonas de climas cálidos y templados.

Las lactonas macrocíclicas a menudo se prescriben como terapéutica o profilácticos en el control de Dirofilaria immitis en aplicaciones veterinarias. No obstante, la resistencia a las lactonas macrocíclicas es habitual en diversos parásitos nematodos y parece desarrollarse en D. immitis. Se han descrito numerosas pruebas para la detección de resistencia antihelmínticos en nematodos de ganado y caballos, incluida la prueba de reducción del recuento de huevos en heces, la prueba de la eclosión de huevos, la prueba del desarrollo de larvas en microagar y pruebas moleculares basadas en la resistencia a bencimidazol (revisado en Coles et al., Veterinar y Parasitology 136: 167185 (2006) . Prichard et al. (patente europea EP 0979278) describen una secuencia de P-glucoproteína en Haemonchus contortus que puede ser útil para el diagnóstico de la resistencia a lactonas macrocíclicas en parásitos nematodos. No obstante, sigue existiendo la necesidad de procedimientos para detectar Dirofilaria immitis (gusanos del corazón) que son resistentes a lactonas macrocíclicas.

Sumario de la invención En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para determinar la capacidad de respuesta de un nematodo Dirofilaria immitis a una lactona macrocíclica, comprendiendo dicho procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1, en la que el genotipo CG en las posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1 indica que es probable que el nematodo sea resistente a dicha lactona macrocíclica.

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que posee una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEC ID Nº: 1 sobre la totalidad de su longitud y que comprende el nucleótido guanina (G) en las posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 618 de la SEC ID Nº 1.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit para determinar la capacidad de respuesta de un nematodo Dirofilaria immitis a una lactona macrocíclica, comprendiendo el kit una sonda capaz de determinar el genotipo del nematodo Dirofilaria immitis en las posiciones en un gen de P-glicoproteína del nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para seleccionar un tratamiento para tratar a un animal infectado con un nematodo Dirofilaria immitis, comprendiendo dicho procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1, y seleccionar el tratamiento basado en el genotipo de dicho nematodo. Opcionalmente, el

tratamiento seleccionado puede ser una terapia basada en arsénico, dietilcarbamazina, antibióticos o una combinación de uno o más de los mismos, si el nematodo tiene el genotipo GG en las posiciones en el gen de la Pglicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para seleccionar un profiláctico para prevenir que un animal se infecte con un nematodo Dirofilaria immitis, comprendiendo el procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1, y seleccionar el profiláctico basado en el genotipo de dicho nematodo. Opcionalmente, el profiláctico seleccionado es dietilcarbamazina, si el nematodo tiene el genotipo GG en las posiciones en el gen de la P-glicoproteína del nematodo correspondiente a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº

1.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia representada en la SEC ID Nº: 1.

Los procedimientos de la invención pueden comprender adicionalmente etapas de obtención de una muestra que comprende el nematodo de un sujeto tal como un animal, aislar el nematodo de la muestra, aislar los ácidos nucleicos del nematodo y, opcionalmente, purificar los ácidos nucleicos antes de la etapa de determinar el genotipo del nematodo. Además, el genotipo del nematodo puede determinarse usando técnicas conocidas tales como secuenciación de ADN, hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP) , análisis por micromatriz o enfoques basados en PCR, RT-PCR o qRT-PCR.

Otros aspectos, ventajas y características de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la siguiente descripción de realizaciones específicas de la invención junto con las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos Figura 1: Una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de codificación parcial de la Pglicoproteína (SEC ID Nº 1) . Los SNP se indican en negrita.

Figura 2: Frecuencia del genotipo de SNP en la posición 11 del gen de la P-glicoproteína (* = p-valor significativo) .

Figura 3: Frecuencia del genotipo de SNP combinado en las posiciones 11 y 618 del gen de la P-glicoproteína (* = p-valor significativo) .

Figura 4: Frecuencia del genotipo de SNP combinado en las posiciones 11 y 618 de P-glicoproteína del grupo C.

Figura 5: Regresión lineal del genotipo de la P-glicoproteína GG-GG frente a IVM-LD95 %.

Figura 6: Coeficiente F o desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg, para diez SNP en tres genes: ß-tubulina (tub) , proteína del choque térmico 60 (hsp) , P-glicoproteína (pgp) . F= +1, 100 % homocigoto; F= -1, 100 % heterocigoto. El número al lado del gen corresponde a la posición del SNP en el segmento analizado.

Descripción detallada Las lactonas macrocíclicas, incluidas, entre otras, avermectinas y milbemicinas, son productos, o derivados químicos de los mismos, de microorganismos del suelo que pertenecen al género Streptomyces. Estas moléculas se usan ampliamente para tratar cientos de especies de endo y ectoparásitos en una amplia gama de huéspedes. Las avermectinas de uso comercial incluyen, entre otras, ivermectina, abamectina, doramectina, eprinomectina y selamectina. Las milbemicinas incluyen, sin limitaciones, milbemicina oxima y moxidectina. Las lactonas macrocíclicas poseen un potente y amplio espectro antiparasitario a niveles de dosis bajas. Son activos contra muchos nematodos inmaduros (incluidas larvas hipobióticas) y artrópodos. Una única dosis terapéutica puede permanecer a concentraciones suficientes para ser eficaces... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de determinación de la capacidad de respuesta de un nematodo Dirofilaria immitis a una lactona macrocíclica, comprendiendo dicho procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1, en la que el genotipo GG en dichas posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº 1 indica que es probable que el nematodo sea resistente a dicha lactona macrocíclica.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la lactona macrocíclica es ivermectina, selamectina, milbemicina oxima o moxidectina.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la secuencia de ácido nucleico de la P

glicoproteína del nematodo posee una identidad de al menos 80 %, preferentemente una identidad de al menos 90 %, con la SEC ID Nº: 1 sobre la totalidad de su longitud, o en el que la secuencia de ácido nucleico de la Pglicoproteína del nematodo es idéntica a la SEC ID Nº: 1 sobre la totalidad de su longitud.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el genotipo del nematodo se determina mediante secuenciación del ADN, hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP) , análisis por micromatriz o enfoques basados en PCR, RT-PCR o qRT-PCR; o el genotipo del nematodo se determina usando una sonda, tal como un oligonucleótido, un aptámero o un anticuerpo.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el oligonucleótido es un cebador.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada que posee una identidad de secuencia de al menos 80 %,

preferentemente de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 1 sobre la totalidad de su longitud o que es idéntica con la SEC ID Nº: 1 sobre la totalidad de su longitud, comprendiendo dicha secuencia el nucleótido guanina (G) en las posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 618 de la SEC ID Nº 1.

7. Un kit de determinación de la capacidad de respuesta de un nematodo Dirofilaria immitis a una lactona macrocíclica, comprendiendo el kit:

una sonda capaz de determinar el genotipo del nematodo Dirofilaria immitis en las posiciones en un gen de la P-glicoproteína del nematodo correspondiente a las posiciones 11 y 618 de la SEC ID Nº: 1.

8. El kit de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la lactona macrocíclica es ivermectina, selamectina, milbemicina oxima o moxidectina.

9. El kit de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la sonda es un oligonucleótido, un aptámero o un 30 anticuerpo.

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el oligonucleótido es un cebador.

11. Un procedimiento de selección de un tratamiento para tratar a un animal infectado con un nematodo Dirofilaria immitis, comprendiendo el procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº: 1, y

seleccionar el tratamiento en base al genotipo de dicho nematodo en dichas posiciones correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº: 1.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho tratamiento seleccionado es una terapia basada en arsénico, dietilcarbamazina, antibióticos o una combinación de uno o más de los mismos, si el nematodo tiene el genotipo GG en dichas posiciones en el gen de la P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº: 1.

13. Un procedimiento de selección de un profiláctico para prevenir la infección de un animal con un nematodo Dirofilaria immitis, comprendiendo el procedimiento determinar el genotipo de dicho nematodo en las posiciones en un gen de P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº: 1, y seleccionar el profiláctico en base al genotipo de dicho nematodo en dichas posiciones 45 correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº: 1.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho profiláctico seleccionado es dietilcarbamazina si el nematodo tiene el genotipo GG en dichas posiciones en el gen de la P-glicoproteína de dicho nematodo correspondientes a las posiciones 11 y 618 en la SEC ID Nº: 1.