Láminas de células para la formación de la ectocórnea, método para producir las mismas y método para usar las mismas.

Una lámina de células formadoras del epitelio corneal que está caracterizada por que está en contacto con un transportador anular que evita la contracción de la lámina de células,

cuyo transportador anular se selecciona de una membrana polimérica, una estructura moldeada a partir de una membrana polimérica o un accesorio de fijación metálico, donde, cuando se usa un polímero, se selecciona del grupo que consiste en difluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, celulosas, derivados de celulosa, papeles, quitina, quitosano, colágeno o uretano; cuya lámina de células en contacto con un transportador anular es obtenible despegándola de una superficie de un soporte de cultivo después de poner en contacto la lámina de células sobre la superficie de soporte de cultivo con dicho transportador anular.

Láminas de células para la formación de la ectocórnea, método para producir las mismas y método para usar las mismas 5

Campo técnico de lainvención Esta invención se refiere a las láminas de células que forman el epitelio corneal tal como se define en la reivindicación 1 en biología, medicina y otros campos, así como a los procesos para producir dichas láminas y métodos terapéuticos que las usan.

Técnica anterior Junto con los marcados avances en la tecnología médica, la realización de trasplantes de órganos, es decir, el reemplazo de un órgano difícil de tratar por el órgano de otra persona, se ha vuelto popular recientemente. Los órganos que pueden trasplantarse son muy diversos e incluyen la piel, la córnea, el riñón, el hígado y el corazón, y además, el progreso postoperatorio de los trasplantes de órganos ha mejorado tan notablemente que ya se han establecido como un procedimiento médico. La queratoplastia es un ejemplo y ya hace 40 años, se organizó un banco ocular en Japón para comenzar las actividades de trasplante. Sin embargo, hasta ahora, el número de donantes en Japón es muy pequeño y, a pesar del hecho de que anualmente existen aproximadamente 20000 pacientes que necesitan una queratoplastia, solamente una décima parte de ellos (aproximadamente 2000 en número) pueden tratarse realmente mediante ese procedimiento. Aunque la queratoplastia es un procedimiento prácticamente establecido, soporta del problema de la falta de donantes, lo que da lugar a la necesidad del desarrollo de un procedimiento médico de última generación.

Con estos antecedentes, se ha prestado atención al procedimiento del trasplante directo de sustitutos artificiales o células que se cultivaron en un montaje. Ejemplos típicos de este enfoque, son la piel artificial y la piel cultivada. Sin embargo, la piel artificial que usa polímeros sintéticos tiene el potencial de causar rechazo y otros efectos secundarios que pueden hacer que estos sean indeseables como injertos de piel. Por otro lado, la piel cultivada se prepara cultivando una parte de la piel normal del paciente hasta que esta crece a un tamaño deseado, de modo que pueda usarse sin el riesgo de causar rechazo y cualquier otro efecto secundario y pueda describirse bien como el agente enmascarante más natural.

De modo convencional, dicho cultivo celular se ha realizado ya sea sobre la superficie de vidrio o sobre la superficie de polímeros sintéticos que se sometieron a una serie de tratamientos. Por ejemplo, una serie de recipientes de poliestireno que se sometieron a tratamientos de superficie tales como la irradiación con rayos y el recubrimiento de silicona se han vuelto populares para su uso en el cultivo celular. Las células que se han cultivado para que crezcan en esos recipientes para cultivos se han despegado y han recubierto las superficies de los recipientes mediante un tratamiento con proteinasas tales como la tripsina o con reactivos químicos.

Sin embargo, se ha señalado que la recuperación de las células que han crecido mediante el tratamiento con reactivos químicos implica algunas desventajas tales como las etapas de procesamiento, complicándose hasta el aumento de las posibilidades de contaminación por impurezas y el crecimiento de células que se desnaturalizan o se dañan por el tratamiento químico teniendo sus funciones inherentes dañadas. Con el fin de superar estas 45 desventajas, se han propuesto varias técnicas hasta la fecha.

El documento JP 2-23191 B describe un método para producir una membrana trasplantable de tejido queratinoso que comprende las etapas de cultivar células epidérmicas queratinizadas neonatales humanas en un recipiente de cultivo en condiciones que permitan que se forme una membrana de tejido queratinoso en la superficie del recipiente y que se despegue la membrana de tejido queratinoso usando una enzima. Específicamente, cuando se usan células 3T3 como capa nodriza, las células epidérmicas crecen y se estratifican como una lámina de células que se recupera usando la proteinasa dispasa. Sin embargo, el método descrito en el documento JP 2-23191 B tiene los siguientes defectos.

(1) La dispasa es de origen microbiano y la lámina de células recuperada necesita un lavado exhaustivo.

(2) Las condiciones para el tratamiento con dispasa difieren de un lote de cultivo celular a otro y se requiere una gran habilidad en el tratamiento.

(3) Las células epidérmicas cultivadas se activan patológicamente por el tratamiento con dispasa.

(4) La matriz extracelular se descompone por el tratamiento con dispasa.

(5) Como resultado, el sitio enfermo en el que se ha injertado la lámina de células es propenso a la infección.

Además de estos defectos del método de la técnica anterior, se contempla en la presente invención que las células relacionadas con el segmento anterior, tales como las células epiteliales corneales, las células endoteliales corneales, y las células epiteliales conjuntivas, no tienen una unión intercelular tan fuerte como las células dérmicas 65 y tienen el problema de que las células cultivadas no pueden despegarse y recuperarse como una sola lámina incluso si se emplea la dispasa.

Con el fin de resolver este problema, se ha ideado recientemente una técnica, de acuerdo con la cual se cultivan las células epiteliales corneales o células epiteliales conjuntivas montadas sobre un amnion desprovisto de la capa esponjosa y la capa epitelial y el montaje se usan como un injerto celular junto con el amnion (documento JP 2001161353 A) . Dado que el amnion tiene la fuerza adecuada como una membrana pero no tiene antigenicidad, es favorable como un soporte de injertos celulares; sin embargo, el amnion no está inherentemente en el ojo y con el fin de construir un tejido intraocular más preciso, se desea la preparación de una lámina fuerte satisfactoria solamente a partir de las células intraoculares y que la lámina tenga contacto directo con el tejido estromal corneal.

En la Solicitud de Patente Japonesa Nº. 2001-226141, se cultivan células relacionadas con el segmento anterior en un soporte de cultivo celular que comprende un sustrato que tiene su superficie recubierta con un polímero que responde a la temperatura que tiene una temperatura crítica inferior o superior de 0-80 °C a la que se disuelve en agua y, en caso necesario, la capa de células cultivadas se estratifica por el método habitual y la lámina de células cultivadas se despega simplemente cambiando la temperatura del soporte. La lámina de células despegada tiene la fuerza adecuada. También retiene una proteína similar a la membrana basal y, en comparación con la lámina de células recuperada por el tratamiento con dispasa que se describe anteriormente, obviamente se establece mejor en el tejido. Sin embargo, considerando la necesidad de reducir la verdadera carga sobre los pacientes, se desea una mejora adicional del establecimiento.

Recientemente, también se han propuesto varios métodos en la organización clínica. Por ejemplo, el documento WO 98/31316 ha propuesto una técnica que utiliza una lámina de células epiteliales corneales cultivadas en el tratamiento de la miopía mediante el método PRK o el método LASIK. Sin embargo, la lámina de células epiteliales corneales descrita en el documento WO 98/31316 se ha despegado mediante tratamiento con dispasa y tiene el problema de que se adhiere demasiado poco al tejido corneal extirpado con láser de modo que no se puede alcanzar una eficacia terapéutica significativa.

Lindeberg K. et al., 1993 describe células epiteliales corneales cultivadas, que crecen en láminas de células que consisten en capas de células epiteliales. El documento no describe una lámina de células en contacto con un transportador anular.

Schwab IR., 1999 divulga células madre epiteliales cultivadas en el estroma corneal o en la membrana amniótica. Las células cultivadas se usaron para el trasplante en ojos lesionados en modelos animales y en seres humanos. El documento no describe una lámina de células en contacto con un transportador anular.

El documento WO 99/37752 describe una matriz de córnea artificial que comprende un endotelio en contacto con la 35 matriz estromal. El documento no describe una lámina de células en contacto con un transportador anular.

Kinoshita Shigeru, 2002 describe el cultivo de células madre epiteliales sobre la membrana amniótica, así como un epitelio de a mucosa oral cultivado. El documento no describe una lámina de células en contacto con un transportador anular.

En un nuevo artículo del 10 de mayo de 2001 expedido en el Mainichi, se propuso una técnica mediante la cual se pegó una mucosa oral cultivada en lugar de la córnea en un... [Seguir leyendo]

1. Una lámina de células formadoras del epitelio corneal que está caracterizada por que está en contacto con un transportador anular que evita la contracción de la lámina de células, cuyo transportador anular se selecciona de una membrana polimérica, una estructura moldeada a partir de una membrana polimérica o un accesorio de fijación metálico, donde, cuando se usa un polímero, se selecciona del grupo que consiste en difluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, celulosas, derivados de celulosa, papeles, quitina, quitosano, colágeno o uretano; cuya lámina de células en contacto con un transportador anular es obtenible despegándola de una superficie de un soporte de cultivo después de poner en contacto la lámina de células sobre la superficie de soporte de cultivo con dicho transportador anular.

2. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con la reivindicación 1 obtenible despegándola de un soporte sin someterla a ningún tratamiento con una proteinasa, teniendo la lámina de células despegada una contracción no superior al 20 %.

3. La lámina de células de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que tiene al menos el 80 % de una proteína de la membrana basal que se mantiene intacta.

4. La lámina de células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que tiene al menos el 80 % de una estructura de desmosomas que se mantiene intacta.

5. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, obtenible despegándola dentro de un periodo de 21 días después de que las células se volvieran confluentes sobre una superficie de soporte.

6. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es una lámina de células epiteliales corneales regeneradas que es de una monocapa o está estratificada.

7. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con la reivindicación 6, que es una lámina estratificada obtenida mediante el cultivo de células corneales epiteliales en capas.

8. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es una lámina de células epiteliales corneales sustitutas que es de una monocapa o está estratificada.

9. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con la reivindicación 8, donde la lámina de células epiteliales corneales sustitutas comprende células de la mucosa oral, células de la raíz pilosa o células epiteliales conjuntivas, tal como se toman individualmente o en una mezcla de dos o más tipos, o en una mezcla de las mismas con células epiteliales corneales.

10. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que es una lámina estratificada obtenible mediante cultivo de células de la mucosa oral, células de la raíz pilosa o células epiteliales conjuntivas en capas, tal como se toman individualmente o en una mezcla de dos o más tipos, o en una mezcla de las mismas con células epiteliales corneales.

11. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, donde las células de la mucosa oral se originan a partir de la membrana bucal.

12. La lámina de células del epitelio corneal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en un método para tratar un sitio enfermo donde un segmento anterior del tejido está dañado parcial o completamente o es deficiente.

13. La lámina de células formadoras del epitelio corneal para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 12, donde el segmento anterior del tejido es un tejido epitelial corneal, membrana de Bowman o un tejido estromal corneal.

14. La lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en un método para tratar un sitio enfermo aplicándola de modo que recubra el sitio enfermo sin suturar.

15. La lámina de células formadoras del epitelio corneal para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, que es obtenible cortando al tamaño y la forma del sitio enfermo antes de aplicarla para cubrir el sitio enfermo.

16. Un proceso para producir una lámina de células formadoras del epitelio corneal, que comprende las etapas de cultivar las células formadoras del epitelio corneal en un soporte de cultivo celular que comprende un sustrato que

tiene su superficie cubierta con un polímero que responde a la temperatura en el cual varía la fuerza de hidratación en un intervalo de temperatura de 0-80 °C con respecto al agua, y posteriormente, 13

(1) ajustar la temperatura de la solución de cultivo bien por encima de una temperatura crítica de disolución superior o bien por debajo de una temperatura crítica de disolución inferior, (2) llevar las células formadoras del epitelio corneal cultivadas a un contacto con un transportador anular de 5 modo que se inhiba la contracción de la lámina de células, y (3) despegar la lámina junto con el transportador anular.

17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16, donde la lámina de células formadoras del epitelio corneal es una lámina de células epiteliales corneales regeneradas o una lámina de células del epitelio corneal sustitutas, cada una 10 de las cuales es de una monocapa o está estratificada.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, donde el soporte de cultivo celular es un inserto celular basado en una membrana.

19. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde el polímero que responde a la temperatura es poli (N-isopropilacrilamida) .

20. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-19, donde la estructura es de forma anular con un corte en el centro. 20

21. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-20, donde la lámina se despega sin tratamiento con una proteinasa.

22. Uso de una lámina de células formadoras del epitelio corneal de acuerdo con una cualquiera de las

reivindicaciones 1-11 para la fabricación de una composición de injerto para el tratamiento de un sitio enfermo donde un segmento anterior del tejido está parcial o completamente dañado o es deficiente, injertando dicha lámina de células formadoras del epitelio corneal.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, donde la lámina injertada cubre el sitio enfermo sin suturar. 30

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, donde la lámina de células formadoras del epitelio corneal se corta al tamaño y la forma del sitio enfermo antes de aplicarla para recubrir el sitio enfermo.

25. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 24, donde la enfermedad a tratar es la 35 erosión corneal, la úlcera corneal o una enfermedad binocular conjuntiva refractaria.

26. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 25, donde el tratamiento implica la corrección refractaria por el método RK, el método PRK, el método LASIK, o el método LASEK.