Láminas celulares relacionadas con el segmento ocular anterior, estructuras tridimensionales, y procesos para producir las mismas.

Un proceso para producir una lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior,

que comprende las etapas de:

cultivar células relacionadas con el segmento ocular anterior en un soporte de cultivo celular que comprende un sustrato que tiene su superficie cubierta con un polímero sensible a temperatura que tiene una temperatura de disolución crítica superior o inferior de 0-80ºC con respecto al agua, para formar una lámina celular de células relacionadas con el segmento ocular anterior,

ajustar la temperatura de la solución de cultivo hasta por encima de la temperatura de disolución crítica superior o hasta por debajo de la temperatura de disolución crítica inferior,

poner la lámina celular de células relacionadas con el segmento ocular anterior en estrecho contacto con una membrana polimérica,

desprender la lámina celular de células relacionadas con el segmento ocular anterior junto con la membrana polimérica del soporte de cultivo celular sin tratamiento con proteinasa,

donde:

las células relacionadas con el segmento ocular anterior son células endoteliales de la córnea;

el polímero sensible a temperatura es poli(N-isopropilacrilamida); y la membrana polimérica está hecha de difluoruro de polivinilideno convertido en hidrófilo.

Láminas celulares relacionadas con el segmento ocular anterior, estructuras tridimensionales, y procesos para producir las mismas 5

Campo técnico de la invención Esta invención se refiere a láminas celulares relacionadas con el segmento ocular anterior y estructuras tridimensionales en biología, medicina y otros campos, así como procesos para producir dichas láminas, y métodos terapéuticos que las usan.

Técnica antecedente Con los marcados avances en tecnología médica, recientemente ha llegado a ser popular realizar trasplantes de órganos, es decir, reemplazar un órgano difícil de tratar con un órgano de otra persona. Los órganos que pueden trasplantarse son bastante diversos e incluyen la piel, córnea, riñón, hígado y corazón, y además, el progreso postoperatorio de los trasplantes de órgano ha mejorado tan remarcablemente que ya se han llegado a establecer como procedimiento médico. La queratoplastia es un ejemplo y tan pronto como hace 40 años, se organizó un banco de ojos en Japón para comenzar actividades de trasplante. Sin embargo, hoy en día, la cantidad de donantes en Japón es muy pequeña y a pesar del hecho de que hay anualmente aproximadamente 20.000 pacientes que necesitan queratoplastia, solamente una décima parte de ellos (aprox. 2.000 en cantidad) puede realmente tratarse por ese procedimiento. Aunque la queratoplastia es un procedimiento virtualmente establecido, tiene el problema de la escasez de donantes, dando lugar a la necesidad del desarrollo de un procedimiento médico de nueva generación.

Con estos antecedentes, se ha puesto atención al procedimiento de trasplantar directamente sustitutos o células artificiales que se cultivaron en ensamblaje. Ejemplos típicos de este enfoque son la piel artificial y la piel cultivada. Sin embargo, la piel artificial que usa polímeros sintéticos tiene el potencial de causar rechazo y otros efectos secundarios que lo hacen indeseable como injertos de piel. Por otro lado, la piel cultivada se prepara cultivando una parte de piel normal del paciente hasta que crece a un tamaño deseado, de modo que pueda usarse sin el riesgo de causar rechazo y cualquier otro efecto secundario y puede describirse bien como el agente de cubrimiento más natural.

Convencionalmente, dicho cultivo celular se ha realizado sobre la superficie de vidrio o sobre la superficie de polímeros sintéticos que se sometieron a una diversidad de tratamientos. Por ejemplo, una diversidad de recipientes de poliestireno que se sometieron a tratamientos superficiales tales como irradiación con rayos-γ y recubrimiento con silicona han llegado a ser populares para su uso en cultivo celular. Las células que se han cultivado para crecer en esos recipientes para cultivo celular se desprenden y recuperan de las superficies de los recipientes por tratamiento con proteinasas tales como tripsina o reactivos químicos.

Sin embargo, se ha señalado que la recuperación de células cultivadas por tratamiento con reactivos químicos implica algunas desventajas tales como las etapas de procesamiento que llegan a ser complejas por aumentar la probabilidad de contaminación por impurezas y que las células cultivadas llegan a desnaturalizarse o dañarse por el tratamiento químico hasta tener sus funciones inherentes lesionadas. Para superar estas desventajas, se han 45 propuesto hasta la fecha varias técnicas.

Nishida, Medical Science Digest, 2002, analiza la posibilidad de establecer ingeniería tisular del epitelio de la córnea para trasplantar una lámina celular cultivada con el uso de una placa de cultivo sensible a temperatura.

Nishida, Journal of Japanese Society of Biomaterials, 2002, también analiza la ingeniería tisular de la córnea para trasplante. El documento se refiere a la posibilidad del desarrollo futuro de ingeniería tisular del endotelio de la córnea sobre la substantia propria, y un método para inyectar células endoteliales en la cámara anterior del ojo.

Yamato et al, Tissue Engineering, 2001, describe el cultivo y recolección de láminas multiestratificadas de 55 queratinocitos usando placas de cultivo termosensibles sin el uso de la enzima proteolítica dispasa.

Kinoshita, Nippon Ganka Gakkai zasshi, 2002, describe la fabricación de una lámina celular endotelial corneal humana sobre una membrana amniótica.

El documento JP 2-23191 B describe un método para producir una membrana trasplantable de tejido de queratina que comprende las etapas de cultivar células epidérmicas queratinizadas neonatales humanas en un recipiente de cultivo en condiciones que posibilitan que se forme una membrana de tejido de queratina sobre la superficie del recipiente y desprender la membrana de tejido de queratina usando una enzima. Específicamente, con células 3T3 usadas como capa de alimentación, las células epidérmicas se cultivan y estratifican como una lámina celular que se 65 recupera usando la proteinasa dispasa. Sin embargo, el método descrito en el documento JP 2-23191 B ha tenido los siguientes defectos.

(1) La dispasa es de origen microbiano y la lámina celular recuperada tiene que lavarse minuciosamente.

(2) Las condiciones para el tratamiento con dispasa difieren de un lote de cultivo celular a otro y se requiere una gran habilidad en el tratamiento.

(3) Las células epidérmicas cultivadas se activan patológicamente por el tratamiento con dispasa. 5 (4) La matriz extracelular se descompone por el tratamiento con dispasa.

(5) Como resultado, el sitio enfermo en el cual se ha injertado la lámina celular es propenso a infección.

Sin embargo, las células relacionadas con el segmento ocular anterior que se contemplan en la presente invención, es decir, células endoteliales de la córnea no tienen una unión intracelular tan fuerte como las células dérmicas y ha sido imposible desprender y recuperar células cultivadas como una única lámina incluso si se emplea la dispasa.

Para resolver este problema, recientemente se ha ideado una técnica, de acuerdo con la cual se cultivan células epiteliales de la córnea o células epiteliales de la conjuntiva en ensamblaje sobre un amnios desprovisto de la capa esponjosa y la capa epitelial y el ensamblaje se usa como injerto celular junto con el amnios (documento JP 2001

161353 A o Kinoshita Shipero, 2002) . Como el amnios tiene resistencia adecuada como membrana pero no tiene antigenicidad, es favorable como soporte de injertos celulares; sin embargo, el amnios no está de forma inherente en el ojo y para construir un tejido intraocular más preciso, se ha deseado la preparación de una lámina satisfactoriamente fuerte solamente a partir de células intraoculares.

La presente invención se ha conseguido con una visión para resolver los problemas mencionados anteriormente de la técnica previa. Por lo tanto, la presente invención tiene como objeto proporcionar una lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior que tiene solamente unos pocos defectos estructurales ya que se han recuperado reteniendo la estructura intercelular de desmosoma y la proteína tipo membrana basal entre la célula y el sustrato. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso mediante el cual puedan desprenderse células cultivadas y crecidas y recuperarse de una superficie de sustrato fácilmente y como una única lámina satisfactoriamente fuerte cambiando la temperatura ambiental sin tratamiento con una enzima tal como dispasa.

Sumario de la invención Para conseguir los objetos indicados, los presentes inventores participaron en actividades de I+D adoptando diversos ángulos de estudio. Como resultado, los inventores descubrieron que una lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior que tiene menos defectos estructurales podría obtenerse mediante un proceso que comprende las etapas de cultivar células relacionadas con el segmento ocular anterior en un soporte de cultivo celular que comprende un sustrato que tiene su superficie cubierta con un polímero sensible a temperatura, después de ello ajustar la temperatura de la solución de cultivo hasta por encima de una temperatura de disolución crítica superior o por debajo de una temperatura de disolución crítica inferior, poner la lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior cultivada o estructura tridimensional en estrecho contacto con una membrana polimérica, y desprender la lámina o estructura tridimensional junto con la membrana polimérica. La presente invención se ha conseguido en base a este hallazgo, como se define adicionalmente en las reivindicaciones.

Por tanto, la presente invención proporciona en primer lugar:

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1. Un proceso para producir una lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior, que comprende las etapas de:

cultivar células relacionadas con el segmento ocular anterior en un soporte de cultivo celular que comprende un sustrato que tiene su superficie cubierta con un polímero sensible a temperatura que tiene una temperatura de disolución crítica superior o inferior de 0-80º C con respecto al agua, para formar una lámina celular de células relacionadas con el segmento ocular anterior,

ajustar la temperatura de la solución de cultivo hasta por encima de la temperatura de disolución crítica superior

o hasta por debajo de la temperatura de disolución crítica inferior, poner la lámina celular de células relacionadas con el segmento ocular anterior en estrecho contacto con una membrana polimérica, desprender la lámina celular de células relacionadas con el segmento ocular anterior junto con la membrana

polimérica del soporte de cultivo celular sin tratamiento con proteinasa, donde:

las células relacionadas con el segmento ocular anterior son células endoteliales de la córnea; el polímero sensible a temperatura es poli (N-isopropilacrilamida) ; y la membrana polimérica está hecha de 20 difluoruro de polivinilideno convertido en hidrófilo.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde una cobertura del polímero sensible a temperatura está en el intervalo de 0, 8 a 3, 0 μg/cm2.

3. Una lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior que se puede obtener por proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. La lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior de acuerdo con la reivindicación 3, donde la lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior está en estrecho contacto con la membrana polimérica hecha de 30 difluoruro de polivinilideno convertido en hidrófilo.

5. La lámina celular relacionada con el segmento ocular anterior de acuerdo con la reivindicación 3, para su uso en el tratamiento de un sitio enfermo en que parte o todo el tejido del segmento ocular anterior se ha dañado o ha llegado a ser deficiente.