Un proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa para su uso en injertos,

que comprende cultivar células epidérmicas en un soporte de cultivo celular que tiene una superficie de sustrato recubierta con un polímero sensible a temperatura cuya temperatura de solución crítica superior o inferior en agua es 0-80 °C, para obtener una lámina celular cultivada multicapa de células epidérmicas, llevar la temperatura de la solución de cultivo por encima de la temperatura de solución crítica superior o por debajo de la temperatura de solución crítica inferior, poner la lámina celular en contacto cercano con una membrana polimérica y desprender la lámina celular junto con una membrana polimérica, en el que las células epidérmicas se cultivan en presencia de células 3T3 crecidas como una capa de alimentación que forman de este modo la lámina celular cultivada multicapa de células epidérmicas, en el que la célula epidérmica es una seleccionada del grupo que consiste en queratinocitos y célula de membrana mucosa, en el que la membrana polimérica se selecciona del grupo que consiste en poliviniliden difluoruro (PVDF) , celulosa y sus derivados y en el que el desprendimiento de la lámina celular no implica tratamiento con una enzima proteolítica.

Lámina celular epidérmica cultivada, lámina cutánea cultivada multicapa y proceso para producir las mismas

Campo técnico

La presente invención se refiere a un proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa y el uso de un método terapéutico de esas láminas.

Antecedentes de la técnica

Cuando se produce daño en la piel tal como quemaduras, debe tenerse mayor cuidado acerca de infecciones bacterianas de la piel lesionada por quemadura y similares. La piel muerta es particularmente susceptible de proliferación extensiva de diversos gérmenes. Por lo tanto, la piel muerta debe retirarse para asegurar que no proliferarán diversos gérmenes. Sin embargo, la retirada de la piel proporciona un sitio para infección bacteriana. Para prevenir dicha infección bacteriana, el sitio del que se ha retirado la piel debe enmascararse con un material adecuado para evitar la entrada de bacterias. Los materiales de enmascaramiento que pueden usarse para este fin incluyen materiales poliméricos sintéticos y una piel cultivada. Sin embargo, los polímeros sintéticos pueden potencialmente provocar rechazo y similares y no se prefieren como injertos cutáneos. Por otro lado, la piel cultivada es una parte de la piel normal del propio paciente que se ha cultivado a un tamaño deseado, de modo que pueda usarse sin ninguna inconveniencia posible tal como rechazo y puede describirse bien como el material de enmascaramiento más natural.

El cultivo celular del tipo descrito anteriormente se ha realizado convencionalmente en la superficie de vidrio o las superficies de polímeros sintéticos sometidos a diversos tratamientos. Por ejemplo, una diversidad de recipientes y similares que están compuestos de poliestireno y que se han sometido a tratamientos superficiales tales como radiación con rayos gamma y recubrimiento de silicona se usan extensivamente como recipientes de cultivo celular. Las células que se han cultivado y han crecido en dichos recipientes de cultivo celular se desprenden y recuperan de la superficie del recipiente mediante tratamiento con enzimas proteolíticas tales como tripsina o agentes químicos.

Sin embargo, se ha indicado que existen varios defectos en la recuperación de células cultivadas por dicho tratamiento con agentes químicos; en primer lugar, el proceso de tratamiento es suficientemente complicado para aumentar la posibilidad de contaminación por impurezas; en segundo lugar, las células crecidas se desnaturalizan o dañan por el tratamiento químico y sus funciones inherentes se ven perjudicadas en algunos casos. Con la intención de superar estas dificultades, se han propuesto hasta el momento varias técnicas.

La Publicación de Patente Japonesa Nº 23191-190 describe un método para producir membranas trasplantables de tejido queratinoso cultivando queratinocitos de un neonato humano en un recipiente de cultivo en condiciones en la que se forma una membrana de tejido queratinoso sobre la superficie del vaso y desprendiendo enzimáticamente la membrana de tejido queratinoso. Se describe específicamente la técnica en la que se cultivan células 3T3 como una capa de alimentación y se apilan en múltiples capas y la lámina celular resultante se recupera con una enzima proteolítica dispasa. Sin embargo, el método descrito en la patente ha tenido los siguientes defectos.

(1) La dispasa de origen bacteriano y la lámina celular recuperada debe lavarse exhaustivamente.

(2) Las condiciones de tratamiento con dispasa difieren de una célula cultivada a otra y el tratamiento requiere gran habilidad.

(3) Las células epidérmicas cultivadas se activan patológicamente por tratamiento con dispasa.

(4) El tratamiento con dispasa descompone la matriz extracelular.

(5) Como resultado, la parte enferma en la que se ha injertado la lámina celular recuperada es susceptible de infección.

La Patente Japonesa abierta a Inspección Pública Nº 192138/1993 describe un método para cultivar células cutáneas preparando un soporte de cultivo celular que tiene una superficie de sustrato recubierta con un polímero cuya temperatura de solución crítica superior o inferior en el agua es de 0-80 ºC, cultivando células cutáneas en el soporte de cultivo celular a una temperatura por debajo de la temperatura de solución crítica superior o por encima de la temperatura de solución crítica inferior y desprendiendo a continuación las células cutáneas cultivadas llevando la temperatura por encima de la temperatura de solución crítica superior o por debajo de la temperatura de solución crítica inferior. En este método, el cambio de temperatura se emplea para desprender las células del sustrato de cultivo recubierto con el polímero sensible a temperatura; sin embargo, el método no permite un desprendimiento de las células eficaz y la lámina celular obtenida tiene muchos defectos estructurales.

Shirakata et al., 1999 describe una técnica para preparar un tejido tridimensional que comprende las etapas de primero preparar gel de colágeno neutralizado, dispersar fibroblastos dérmicos en el cultivo en gel y después sembrar queratinocitos en el gel después de cultivo de los fibroblastos dérmicos.

Yamato et al., 1998 indica que se cultivaron células parenquimales hepáticas de rata cultivadas primarias en una placa de cultivo sensible a temperatura y se enfriaron para obtener una lámina celular.

Kikuchi et al., 1998 describe métodos para recuperar y transferir cultivos monocapa de células incluyendo membranas de quitina usadas como un soporte de células del extremo apical durante la transferencia de células cultivadas o inserto de cultivo celular usado como un soporte así como un nuevo sustrato que permite que las superficies basales de las células cultivadas se expongan al medio después de la transferencia.

Shirakata et al., 1999 muestra láminas epidérmicas cultivadas obtenidas cultivando solamente queratinocitos en forma de lámina y piel cultivada tridimensional obtenida mediante el cultivo de fibroblastos en gel de colágeno seguido de cultivo de queratinocitos en el gel.

El documento WO 81/01416 describe una técnica en la que se construye una estructura tridimensional extracorporalmente usando tejido queratinoso vivo, que se desprende por proteasa.

Descripción de la invención

La presente invención se ha conseguido en un intento de resolver los problemas anteriormente mencionados de la técnica anterior. Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar un proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa que tenga sólo unos pocos defectos estructurales puesto que se recuperan con estructuras de desmosoma intracelulares y la proteína de membrana basal de célula a sustrato se mantiene intacta. Otro objeto de la invención es proporcionar un método caracterizado por cambiar la temperatura ambiental sin tratamiento con una enzima tal como dispasa y usando una membrana polimérica de modo que las células cultivadas y crecidas puedan desprenderse y recuperarse de la superficie de un soporte fácilmente y sin deformar su morfología.

Para conseguir estos objetos, los presentes inventores realizaron investigación y desarrollo realizando una revisión desde varios ángulos. Como resultado, han descubierto una técnica en la que cuando las células se cultivaron en un soporte de cultivo celular que tenía una superficie de sustrato recubierta con un polímero sensible a temperatura, permitiéndose opcionalmente a la capa de células cultivadas formar capas múltiples y la temperatura de la solución de cultivo se llevó a continuación por encima de una temperatura de solución crítica superior o por debajo de una temperatura de solución crítica inferior de modo que la lámina de células epidérmicas cultivadas o lámina cutánea multicapa estaría en contacto cercano con la membrana polimérica, desprendiéndose después la lámina junto con la membrana polimérica. Los inventores descubrieron que la lámina epidérmica o lámina cutánea multicapa obtenida de este modo tenía solamente unos pocos defectos estructurales. La presente invención se ha conseguido basándose en este hallazgo.

Por tanto, la presente invención proporciona un método para producir una lámina cutánea cultivada multicapa que sólo tiene unos pocos defectos estructurales puesto que se recuperan con estructuras de desmosoma intracelular y la proteína de membrana basal de célula a sustrato se mantiene intacta.

En particular, la presente invención proporciona un proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa para... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa para su uso en injertos, que comprende cultivar células epidérmicas en un soporte de cultivo celular que tiene una superficie de sustrato recubierta con un polímero sensible a temperatura cuya temperatura de solución crítica superior o inferior en agua es 0-80 °C, para obtener una lámina celular cultivada multicapa de células epidérmicas, llevar la temperatura de la solución de cultivo por encima de la temperatura de solución crítica superior o por debajo de la temperatura de solución crítica inferior, poner la lámina celular en contacto cercano con una membrana polimérica y desprender la lámina celular junto con una membrana polimérica, en el que las células epidérmicas se cultivan en presencia de células 3T3 crecidas como una capa de alimentación que forman de este modo la lámina celular cultivada multicapa de células epidérmicas, en el que la célula epidérmica es una seleccionada del grupo que consiste en queratinocitos y célula de membrana mucosa, en el que la membrana polimérica se selecciona del grupo que consiste en poliviniliden difluoruro (PVDF) , celulosa y sus derivados y en el que el desprendimiento de la lámina celular no implica tratamiento con una enzima proteolítica.

2. El proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente permitir que la lámina celular en contacto cercano con la membrana polimérica se adhiera a otra lámina celular en un soporte de cultivo celular; añadir a continuación un medio para desprender la membrana polimérica de la lámina celular; y repetir estos procesos.

3. El proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero sensible a temperatura es poli (N-isopropilacrilamida) .

4. El proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la membrana polimérica es poliviniliden difluoruro hidrofilizado.

5. El proceso para producir una lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la otra lámina celular es al menos un miembro del grupo que consiste en una lámina celular cultivada epidérmica, una lámina cutánea cultivada multicapa, así como una lámina de fibroblastos y una lámina celular endotelial vascular que se puede obtener por el proceso de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Una lámina cutánea cultivada multicapa que se puede obtener por el proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con la reivindicación 6, que se adapta para su uso en el tratamiento de una quemadura y/o una herida que se cortan en profundidad en un tejido cutáneo.

8. Uso de la lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con la reivindicación 6 en la preparación de un injerto para una quemadura y/o una herida que se corta en profundidad en un tejido cutáneo.

9. La lámina cutánea cultivada multicapa de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de una quemadura y/o una herida que se corta en profundidad en un tejido cutáneo.