PROCEDIMIENTO PARA LA TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS VEGETALES Y KIT PARA LLEVAR A CABO DICHO PROCEDIMIENTO.

Procedimiento para la transformación de células vegetales y kit para llevar a cabo dicho procedimiento.

La presente invención se refiere a un procedimiento de transformación de células vegetales que se realiza sin introducir en el genoma de la célula a transformar ninguna secuencia promotora o reguladora distinta al gen a transformar y el kit para llevar a cabo dicho procedimiento.

Procedimiento para la transformación de células vegetales y kit para llevar a cabo dicho procedimiento.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo general de la ingeniería genética y en particular se refiere a un procedimiento para la generación de células vegetales transgénicas.

Estado de la técnica

Las microalgas constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos, mayoritariamente fotosintéticos, con gran importancia ecológica y con un enorme potencial biotecnológico. Varias especies se utilizan actualmente para la producción a gran escala de carotenoides, ácidos 15 grasos poliinsaturados y otros compuestos de alto valor añadido con aplicaciones en la industria alimentaria, dietética, cosmética y de química fina. Más aún, algunas especies de microalgas han sido propuestas como sistemas alternativos para la expresión de proteínas heterólogas, incluyendo anticuerpos y otras proteínas terapeúticas y en los últimos años ha habido un creciente interés en las microalgas como posible materia prima para una tercera 20 generación de biocombustibles renovables con un balance neutral de carbono (Radakovits R, Jinkerson RE, Darzins A, Posewitz MC.

Genetic engineering of algae for enhanced biofuel production.

A pesar del gran interés biotecnológico de las microalgas, no existe un método robusto para la 25 transformación estable de la mayoría de las especies. La primera microalga modificada genéticamente fue la clorofita de agua dulce, Chlamydomonas reinhardtii, transformada en 1989 por complementación de mutantes con los correspondientes genes homólogos. La transformación genética de las diatomeas Cyclotlla criptica and Navicula saprophila fué reportada por primera vez en 1995 y pronto aparecieron otros trabajos describiendo los 30 protocolos para la transformación Phaeodactylum tricornutum. Desde entonces se han desarrollado un importante número de marcadores seleccionables, promotores y nuevos procedimientos para la introducción eficiente de ADN en el núcleo de Chlamydomonas reinhardtii y Phaeodactylum tricornutum. Sin embargo, el número de especies transformadas apenas ha aumentado. 35

El uso de promotores heterólogos ha permitido la expresión transitoria y poco eficiente de genes heterólogos en algunas especies de algas verdes. Pero, en la actualidad, las mejores eficiencias de transformación y los transformantes más estables se obtienen con promotores endógenos. De hecho, la falta de promotores endógenos ha impedido la transformación 40 genética en muchas especies.

Los métodos para introducir los genes deseados en la célula hospedadora son muchos y están bien descritos en la bibliografía científica. Los más usuales para la transformación de microalgas son: el bombardeo de microproyectiles o biolistic, la electroporación, fibras de 45 carburo de silicio, el método de agitación con perlas de vidrio.

Existen métodos para minimizar las secuencias del vector o plásmido que acompañan al gen de interés y por lo tanto son insertados en el genoma de la célula hospedadora (Sizova, I.; Fuhrmann, M.; Hegemann, P. A Streptomyces rimosus aphVIII gene coding for a new type 50 phosphotransferase provides stable antibiotic resistance to Chlamydomonas reinhardtii. Gene 2001; 277: 221-229) pero todos insertan promotores o regiones reguladoras.

Existe pues la necesidad de encontrar un procedimiento de transformación de células en ausencia total de promotores o regiones reguladoras.

Descripción de la invención 5

La presente invención soluciona los problemas planteados en el estado de la técnica ya que describe un procedimiento de transformación de células vegetales en la que la expresión del gen marcador no depende de ningún promotor o región reguladora, ni exógena ni endógena, que haya que introducir en el genoma. Además se evita la introducción innecesaria de secuencias de ADN indeseables en los transformantes, quedando estas reducidas al gen de 10 interés y al gen marcador.

Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la transformación genética de células vegetales (de ahora en adelante procedimiento de la presente invención) que comprende las siguientes etapas: 15

a) introducir en un medio de transformación, el gen marcador, el gen a transformar y un concentrado de las células vegetales a transformar,

b) incubar y someter las células al procedimiento de transformación

c) separación de las células del medio de cultivo 20

d) cultivar las células obtenidas en la etapa c) en un medio de selección

caracterizado por que en la transformación se realiza sin introducir en el genoma de la célula a transformar ninguna secuencia promotora o reguladora distinta al gen a transformar.

En la presente invención el término "transformación" se refiere a la transferencia de un ácido nucleico y su integración al genoma nuclear de las microalgas u otras células vegetales para generar microalgas o células vegetales transgénicas.

En la presente invención el término "gen" se refiere a la secuencia de

nucleótidos

macromolécula

proteínas

ARN mensajero, ribosómico o transferente.

En la presente invención el término "promotor" se refiere al fragmento de ácido nucleico que dirige la expresión del gen o genes (en procariotas) a los que precede. El promotor contiene 35 elementos característicos que facilitan la unión de la ARN polimerasa, responsable de la transcripción del gen o genes situados a continuación promotor.

En la presente invención el término "gen de interés" se refiere a el gen que quiere introducirse en el genoma del hospedador y suele codificar una proteína o péptido, aunque también puede 40 ser transcrito a secuencias de ARN que no codifican ninguna proteína.

En la presente invención el término "vector" se va a utilizar de forma equivalente al término "plásmido" y se refiere a un fragmento de ADN circular que tiene capacidad autónoma de replicación en bacterias de forma independiente del ADN cromosómico. 45

En un aspecto más en particular de la presente invención, las células vegetales son microalgas.

En la presente invención el término "microalga transgénica" se refiere a aquella que contiene 50 uno o varios transgenes o genes exógenos, introducidos en su genoma mediante transformación genética.

Más en particular, en el procedimiento de la presente invención, la transformación se realiza mediante agitación con perlas de vidrio, electroporación o bombardeo de partículas.

Más en particular, la relación gen de interés y gen marcador en el procedimiento de la presente invención, es superior a 3. 5

Más en particular, en el procedimiento de la presente invención, el gen marcador y el gen a transformar no están en el mismo plásmido.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la célula transformada mediante el 10 procedimiento de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención (de ahora en adelante, kit de la presente invención) que comprende:

- el gen marcador 15

- el gen a expresar

- el tubo de transformación

Más en particular, el tubo de transformación comprende perlas de vidrio. Más en particular, el gen marcador y el gen a transformar están incluidos en tubos individuales. 20

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del kit de la presente invención en un procedimiento para transformación de células vegetales según el procedimiento de la presente invención.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra el esquema del protocolo de transformación empleado para la transformación de la microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii.

La figura 2 muestra la placa con medio TAP-paromomicina mostrando las colonias de Chlamydomonas reinhardtii transformantes obtenidas.

La figura 3, muestra el análisis mediante PCR de algunos de los transformantes obtenidos elegidos de forma aleatoria. El ADN genómico de los transformantes: 2-1, 2-2 y 2-3 fue 35 utilizado como molde para una reacción de PCR con cebadores específicos para el gen de interés ars (A) y marcador de resistencia aphVIII (B) . C-, control negativo. MW, marcadores de peso molecular.

Descripción detallada de la invención 40

Para llevar a cabo el procedimiento de la invención se utilizó...

1. Procedimiento para la transformación genética de células vegetales caracterizada por que comprende las siguientes etapas:

a) introducir en un medio de transformación, el gen marcador, el gen a expresar y un concentrado de las células vegetales a transformar,

b) incubar y someter las células al procedimiento de transformación

c) separación de las células del medio de cultivo

d) cultivar las células obtenidas en la etapa c) en un medio de selección 10

caracterizado por que en la transformación se realiza sin introducir en el genoma de la célula a transformar ninguna secuencia promotora o reguladora distinta al gen a transformar.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado por que las células vegetales son microalgas. 15

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que la transformación se realiza mediante agitación con perlas de vidrio, electroporación o bombardeo de partículas.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la relación gen de interés y gen marcador es superior a 3.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el gen marcador y el gen a transformar no están en el mismo plásmido. 25

6. Célula transformada mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Kit para llevar a cabo el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que comprende: 30

- gen marcador

- gen a expresar

- tubo de transformación

8. Kit según la reivindicación 7, caracterizado por que el tubo de transformación comprende perlas de vidrio.

9. kit según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, caracterizado por que el gen marcador y el gen a transformar están incluidos en tubos individuales. 40

10. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en un procedimiento para transformación de células vegetales según las reivindicaciones 1-5.