Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla.

Una molécula de ARN de cadena sencilla que tiene una longitud de 14-50 nucleótidos,

en donde al menos los 14- 20 nucleótidos más próximos a 5' son sustancialmente complementarios a un transcrito diana para uso en terapia, en donde la molécula de ARN tiene un análogo de fosfato en el extremo 5' que se selecciona del 5'-difosfato, 5'- trifosfato, remate de 5'-guanosina 7-metilado o no metilado, remate de 5'-adenosina, cualquier estructura de remate de nucleótidos no modificado N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-OP(HO)(O)-O-5', 5'-monotiofosfato, 5'-monoditiofosfato, 5'-fósforotiolato, cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfatos reemplazados con oxígeno/azufre, 5'-fósforoamidatos, 5'-alquilfosfonatos y 5'-alquiléterfosfonatos, en donde la molécula del ARN de cadena sencilla es capaz de inhibir la expresión de transcritos diana mediante ARN-interferencia.

Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla

La presente invención se refiere a características de la secuencia y estructurales de moléculas de ARN(ss) de cadena sencilla necesarias para mediar en modificaciones de ácido nucleico específicas para la diana mediante interferencia del ARN (ARNi) tales como la degradación del ARNm diana y/o la metilación del ADN.

La mayoría de los eucariotas poseen un sistema de defensa celular que protege sus genomas contra la invasión de elementos genéticos extraños. Se cree que la inserción de elementos extraños va acompañada generalmente de la formación de ARNds que es interpretado por la célula como una señal para la actividad génica indeseada (p. ej., Ahlquist, Science 296 (2002), 1270-1273; Fire et al., Nature 391 (1998), 806-811). Dicer RNasa III procesa rápidamente ARNds a pequeños fragmentos de ARNds de tamaño y estructura distintos (p. ej., Bernstein et al., Nature 409 (2001), 363-366), los ARNs pequeños de interferencia (ARNsi) (Elbashir et al., Genes & Dev. 15 (2001 b), 188-200), que dirigen la degradación específica para la secuencia de los ARNms de cadena sencilla de los genes invasores. ARNsi dúplex tienen extremos colgantes en 3 de 2 a 3 nt (nucleótidos) y contienen extremos 5 fosfato y 3' hidroxilo libres (documento WO 02/44321). El proceso de silenciamiento génico pos-transcripcional dependiente de ARNds se conoce comúnmente como interferencia de ARN (ARNi), y en algunos casos también está ligado al silenciamiento transcrlpclonal.

La introducción experimental de ARNsi dúplex en células de mamífero se utiliza ahora ampliamente para interrumpir la actividad de genes celulares homólogos en secuencia al ARNds introducido. Utilizado como un enfoque genético inverso, el silenciamiento génico inducido por ARNsi acelera el enlace de la secuencia del gen a la función biológica. ARNsi dúplex son lo suficientemente cortos como para evitar efectos no específicos inducidos por ARNds generales en células de animales vertebrados y mamíferos. Los ARNsi también se pueden expresar intracelularmente a partir de plásmidos de expresión introducidas o vectores virales que proporcionan una alternativa a la síntesis química de ARN. Por lo tanto, una comprensión de cómo actúan los ARNsi en sistemas de mamíferos es importante para el perfeccionamiento de esta tecnología de silenciamiento génico y para la producción de agentes terapéuticos específicos para genes.

Estudios bioquímicos han comenzado a desvelar los detalles mecánicos de ARNi. Los primeros sistemas libres de células se desarrollaron utilizando extractos de células o embriones de D. melanogaster, y fueron seguidos por el desarrollo de sistemas in vitro de células de carcinoma embrionario de C.elegans y embrionario de ratón. Mientras que lisados de D. melanogaster apoyan las etapas de procesamiento de ARNds y la fijación como objetivo de ARNm específico para la secuencia, estos dos últimos sistemas sólo recapitulan la primera etapa.

El ARNi en extractos de D. melanogaster se inicia por el procesamiento dependiente de ATP de ARNds largo a ARNsi mediante Dicer RNasa III (p. ej., Bernstein et al., (2001), supra). A partir de entonces, ARNsi dúplex se ensamblan en un complejo multi-componente que guía al reconocimiento específico para la secuencia del ARNm diana y cataliza su escisión (p. ej., Elbashir (2001 b), supra). A este complejo se le alude como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) (Hammond et al., Nature 404 (2000), 293-296). Los ARNsi en D. melanogaster son predominantemente de 21 y 22 nt, y cuando se combinan de manera que contengan una estructura colgante en 3' de 2 nt se introducen de manera efectiva en el RISC (Elbashir et al., EMBO J. 20 (2001 c), 6877-6888). Sistemas de mamíferos tienen ARNsi de un tamaño similar, y ARNsi de 21 y 22 nt también representan los tamaños más eficaces para silenciar los genes expresados en células de mamífero (p. ej., Elbashir et al., Nature 411 (2001 a), 494-498, Elbashir et al., Methods26 (2002), 199-213).

El RISC ensamblado en ARNsi dúplex en lisados de embrión de D. melanogaster fija como objetivo ARNs de cadena sencilla sentido así como antisentido homólogos para la degradación. Los sitios de escisión para los ARNs diana sentido y antisentido están situados en el centro de la región abarcada por el ARNsi dúplex. De manera importante, el extremo 5', y no el extremo 3', del ARNsi guía establece la regla para la posición de la escisión del ARN diana. Además, se requiere un fosfato 5' en la cadena complementaria de la diana de un ARNsi dúplex para la actividad de RISC, y el ATP se utiliza para mantener los 5' fosfatos de los ARNsi (Nykánen et al., Cell 107 (2001), 309-321). ARNsi dúplex sintéticos con colgantes 5' hidroxilo y 3' de 2 nt libres son fosforilados tan fácilmente en lisados de embrión de D. melanogaster que las eficiencias de ARNi de ARNsi 5'-fosforilados y no fosforilados no son significativamente diferentes (Elbashir et al. (2001 c), supra).

El desenrollamiento del ARNsi dúplex debe producirse antes del reconocimiento del ARN diana. Análisis de los requisitos de ATP revelaron que la formación de RISC en ARNsi dúplex requería ATP en lisados de D. melanogaster. Una vez formado, el RSIC escinde el ARN diana en ausencia de ATP. La necesidad de ATP

probablemente refleja la etapa de desenrollamiento y/u otros reordenamientos conformacionales. Sin embargo, actualmente se desconoce si las cadenas desenrolladas de un ARNsi dúplex permanecen asociadas con RISC o si RISC sólo contiene un ARNsi de cadena sencilla.

Un componente asociado con el RISC fue identificado como Argonaute2 a partir de células Schneider 2 (S2) de D. melanogaster (Hammond et al., Science 293 (2001 a), 1146-1150), y es un miembro de una gran familia de proteínas. La familia se conoce como familia Argonaute o PPD y se caracteriza por la presencia de un dominio PAZ y un dominio Plwl C-termlnal, tanto de función desconocida (Cerutti et al., Trends Biochem. Sci. (2000), 481-482); Schwarz y Zamore, Genes & Dev. 16 (2002), 1025-1031). El dominio PAZ también se encuentra en Dicer. Debido a que Dicer y Argonaute2 interactúan en células S2, PAZ puede funcionar como un motivo de interacción proteína- proteína. Posiblemente, la interacción entre Dicer y Argonaute2 facilita la incorporación ARNsi en RISC. En D. melanogaster, la familia Argonaute tiene cinco miembros, la mayoría de los cuales se demostró que está implicada en el silenciamiento y el desarrollo de genes. Los miembros de mamífero de la familia Argonaute están mal caracterizados, y algunos de ellos han sido implicados en el control de la traducción, procesamiento de microARN y el desarrollo. Queda por establecer la función bioquímica de las proteínas Argonaute y el desarrollo de más sistemas bioquímicos es crucial.

En esta memoria, los autores de la Invención Informan sobre el análisis de RISC humano en extractos preparados a partir de células HeLa. La reconstitución de RISC y la etapa de fijación como objetivo del ARNm revelaron que RISC es un complejo de rlbonucleoproteína que se compone de un ARNsi de cadena sencilla. Una vez que se forma el RISC, el ARNsi Incorporado ya no puede Intercambiarse con ARNsi libres. Sorprendentemente, RISC puede ser reconstituido en extractos HeLa S100, proporcionando ARNsi de cadena sencilla. La introducción de ARNsi antlsentldo de cadena sencilla 5-fosforllados en células HeLa silencia potentemente un gen endógeno con una eficacia similar al ARNsi dúplex.

El objeto subyacente de la presente Invención es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar en el ARNi específico para la diana.

La solución de este problema se proporciona mediante el uso de una molécula de ARN de cadena sencilla según se define en la reivindicación 1. Sorprendentemente, se encontró que moléculas de ARN de cadena sencilla son capaces de Inhibir la expresión de transcritos diana mediante la Interferencia del ARN (ARNi).

La longitud de las moléculas de ARN de cadena sencilla es preferiblemente de 14-50 nt, en donde al menos del 14 al 20 en 5' la mayoría de los nucleótidos son sustanclalmente complementarios al transcrito de ARN diana. Los oligonucleótidos de ARN están modificados mediante análogos 5-monofosfato según se define en la reivindicación 1.

La inhibición de la expresión del transcrito diana puede producirse in vitro, p. ej. en cultivos celulares o extractos de células eucarlótlcos, particularmente de mamíferos. Por otro lado, la Inhibición también puede producirse in vivo, es decir, en organismos eucarióticos, particularmente de mamíferos incluyendo los seres humanos.

Preferiblemente, la molécula de ARN de cadena sencilla tiene una longitud... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ARN de cadena sencilla que tiene una longitud de 14-50 nucleótidos, en donde al menos los 14- 20 nucleótidos más próximos a 5 son sustanclalmente complementarios a un transcrito diana para uso en terapia, en donde la molécula de ARN tiene un análogo de fosfato en el extremo 5 que se selecciona del 5-dlfosfato, 5- trifosfato, remate de 5-guanoslna 7-metilado o no metilado, remate de 5-adenoslna, cualquier estructura de remate de nucleótidos no modificado N-0-5-(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0P(H0)(0)-0-5, 5-monotiofosfato, 5-monoditiofosfato, 5-fósforotiolato, cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfatos reemplazados con oxígeno/azufre, 5-fósforoam¡datos, 5-alquilfosfonatos y 5-alquiléterfosfonatos, en donde la molécula del ARN de cadena sencilla es capaz de inhibir la expresión de transcritos diana mediante ARN-interferencia.

2. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ARN tiene una longitud de 15-29 nucleótidos.

3. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicha molécula de ARN es completamente complementaria a dicho transcrito diana opcionalmente con excepción de nucleótidos que se extienden más allá de la posición 20 contada desde el extremo 5.

4. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha molécula de ARN comprende al menos un análogo de nucleótidos modificado.

5. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de la reivindicación 4, en donde los análogos de nucleótidos modificados se seleccionan de ribonucleótidos modificados en la cadena principal de azúcares y modificados en nucleobases y combinaciones de los mismos.

6. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la inhibición de la expresión del gen diana es in vitro.

7. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la inhibición de la expresión del gen diana es in vivo.

8. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha molécula de ARN está formulada como una composición farmacéutica que contiene un soporte farmacéuticamente aceptable.

9. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de la reivindicación 8, en donde dicho soporte se selecciona de liposomas catiónicos y formulaciones de lípidos catiónicas.

10. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha molécula de ARN está asociada con polímeros o micropartículas biodegradables.

11. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de la reivindicación 10, en donde dicha asociación comprende un acoplamiento covalente.

12. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de la reivindicación 11, en donde dicho acoplamiento covalente se produce a través del extremo 3 de la molécula de ARN.

13. La molécula de ARN de cadena sencilla para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde las enfermedades se seleccionan de enfermedades tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas, enfermedades degenerativas y enfermedades autoinmunes.

14. Un método in vitro para inhibir la expresión de un transcrito diana en células de mamífero mediante ARN- interferencia, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dichas células con una molécula de ARN de cadena sencilla que tiene una longitud de 14-50 nucleótidos, en donde al menos los 14-20 nucleótidos más próximos a 5 son sustancialmente complementarios a dicho transcrito diana, en donde la molécula de ARN tiene un análogo de fosfato en el extremo 5 que se selecciona del 5-difosfato, 5-trifosfato, remate de 5-guanosina 7-metilado o no metilado, remate de 5-adenosina, cualquier estructura de remate de nucleótidos modificado o no modificado N-O-5- (H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0P(H0)(0)-0-5, 5-monotiofosfato, 5-monoditiofosfato, 5-fosforotiolato, cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfatos reemplazados con oxígeno/azufre, 5- fosforoamidatos, 5-alquilfosfonatos y 5-alquieterfosfonatos, y

(b) inhibir la expresión de un transcrito diana mediante ARN-interferencia efectuado por el ARN de cadena sencilla hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia sustancialmente complementaria al ARN de cadena sencilla.