Inmunógenos para vacunas contra Meningitidis A.

Un oligosacárido que comprende una primera unidad de manosa y una segunda unidad de manosa,

en el que la primera unidad de manosa comprende un resto de espaciador en la configuración alfa en C-1, espaciador que puede conjugarse con una proteína,

en el que la primera unidad de manosa está conectada a la segunda unidad de manosa mediante un enlace 1,6 que conecta C-6 de la primera unidad con C-1 de la segunda unidad,

y en el que el enlace 1,6 comprende un fosfonato.

Campo técnico La invención se refiere a un compuesto útil para una vacuna contra la meningitis A. Más particularmente, el compuesto es un oligosacárido que comprende un enlace que contiene fósforo estabilizado, preferentemente un enlace fosfonato. El compuesto contiene más preferentemente unidades de manosa y también puede contener un espaciador en la configuración alfa en C-1 de la unidad de manosa. La invención también incluye métodos de preparación del oligosacárido y métodos mejorados de preparación de compuestos y productos intermedios que contienen manosa.

Técnica anterior

La meningitis es una infección de las meninges, el fino revestimiento que rodea el cerebro y la médula espinal. Varios tipos de bacterias pueden producir la meningitis, y N. meningitidis es una de las más importantes. Otras son Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b. Hay varios subgrupos de N. meningitidis, que se diferencian por la estructura del polisacárido capsular que rodea la bacteria.

La meningitis se produce tanto por virus como por bacterias. Los dos tipos principales de bacterias que causan la meningitis son Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis. En el caso de H. influenzae solo un serotipo, el tipo b, es importante, mientras que con N. meningitidis se han identificado doce serogrupos, de los que los grupos A, B, C y W135 son conocidos por producir epidemias. Los diversos serotipos tienen diferente prevalencia geográfica, por ejemplo, el tipo B y C son dominantes en Europa y América del Norte y el tipo A en Ã?frica y América del Sur. El serotipado se basa en la estructura y antigenicidad del polisacárido capsular (PSC) que rodea las bacterias, y el PSC también puede usarse como vacuna contra las bacterias. Pueden prepararse vacunas especialmente eficaces (vacunas de glucoconjugado) uniendo el sacárido a una proteína transportadora. Véase Plotkin, S. A. y Orenstein,

W. A., Vaccines, 4ª ed., Saunders, páginas 959-987 (2004) . Estos glucoconjugados inducen una respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T con memoria y efecto también en niños pequeños, mientras que el PSC no conjugado generalmente deja de proporcionar tanto un efecto de memoria en adultos como cualquier efecto inmunogénico sustancial en lactantes. El desarrollo de vacunas tipo A se ha considerado especialmente difícil, debido a la inestabilidad inherente de los enlaces diéster de fosfato anoméricos que son parte del PSC. La unidad de repetición de tipo A es un monosacárido, 2-acetamido-2-desoxi-α-D-manopiranosa ligada 1→6 mediante un puente fosfodiéster (Figura 1) . En el polisacárido nativo, el 3-OH está acetilado a un grado de aproximadamente el 80 %. La importancia inmunológica de esta acetilación no se ha investigado completamente, pero hay indicaciones de que no es de mayor importancia.

El serogrupo A de Neisseria meningitidis produce brotes epidémicos de meningitis, principalmente en partes delÃ?frica subsahariana en el llamado cinturón de la meningitis. En el cinturón de la meningitis, la incidencia estimada durante el periodo 1970-1992 fue aproximadamente 800.000 casos. Véase Plotkin, S. A. y Orenstein, W. A., Vaccines, 4ª ed., Saunders, páginas 959-987 (2004) . Los brotes epidémicos de meningitis son devastadores para la región, por lo que se necesita urgentemente una vacuna eficaz. La esperanza es, por supuesto, que el desarrollo de una buena vacuna, en combinación con esfuerzos similares a aquellos contra la viruela realizados por la OMS en los años 60 y 70, pueda asimismo eliminar la meningitis causada por el serotipo A de N. meningitidis. Las vacunaciones son una forma mucho más rentable de controlar una enfermedad que el tratamiento con antibióticos y otras terapias, y el coste es especialmente importante en los países en vías de desarrollo.

Las vacunas preparadas a partir del recubrimiento de polisacárido sobre la bacteria, su polisacárido capsular, son eficaces en adultos. La exposición a este polisacárido hace que los adultos desarrollen una respuesta inmunogénica que protege contra la meningitis causada por N. meningitidis. Una gran limitación con tales vacunas es, sin embargo, que el sistema inmunitario de niños menores de dos años de edad no responde a la mayoría de los antígenos de polisacárido. Desafortunadamente, éste es el grupo de edad en mayor riesgo de meningitis bacteriana. Así, las vacunas de polisacárido no son útiles en niños jóvenes. Además, incluso en niños mayores y adultos estas vacunas solo inducen inmunidad a corto plazo. La protección disminuye rápidamente y desaparece generalmente aproximadamente dos años después de la vacunación.

Polisacáridos como los PSC de N. meningitidis son antígenos independientes de linfocitos T, que significa que pueden dar una respuesta inmunitaria sin la participación de linfocitos T (células derivadas del timo) . Esta respuesta carece de varias propiedades importantes que caracterizan la respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T, tal como memoria inmunológica, cambio de clase de IgM a IgG y maduración por afinidad. Si la parte del polisacárido está conectada a una proteína transportadora, sin embargo, desencadena una respuesta inmunitaria celular que crea efecto de memoria, y también da protección en niños jóvenes. Tales polisacáridos ligados a proteínas transportadoras se denominan frecuentemente glucoconjugados, y son especialmente valiosos como vacunas.

Las vacunas de glucoconjugado se llaman así debido a que su producción implica la conjugación de un antígeno de

polisacárido u otro antígeno glucosídico con una proteína transportadora. El resto de sacárido en las vacunas glucoconjugadas es normalmente un PSC bacteriano funcionalizado, pero también puede ser sintético. Las estructuras de hidratos de carbono sintéticas tienen varias ventajas posibles con respecto a aquellas basadas en hidratos de carbono de fuentes naturales. Los hidratos de carbono naturalmente derivados son mezclas heterogéneas y pueden incluir pequeñas cantidades de impurezas y contaminantes naturales. A diferencia, pueden producirse hidratos de carbono sintéticos como compuestos individuales homogéneos de una manera controlada, con poca o ninguna variabilidad de lote a lote. Otra ventaja de las estructuras sintéticas es que pueden prepararse para incluir grupos funcionales para la derivatización o modificaciones del resto de hidrato de carbono que son difíciles o imposibles de realizar sobre el material nativo. La proteína transportadora es un factor importante en la modulación de la inmunogenicidad. Se han usado diversos transportadores para la conjugación, y los mejores resultados se han conseguido usando versiones desintoxicadas de proteínas fuertemente inmunogénicas como toxinas de la difteria y el tétanos, que se han autorizado para su uso en seres humanos. Véase la patente de EE.UU. nº 4.354.170. También se ha mostrado que el sistema inmunitario reacciona más eficazmente cuando los pacientes ya se han inmunizado con la proteína transportadora particular.

Una vacuna de glucoconjugado se prepara normalmente conjugando la estructura del polisacárido capsular nativo de la bacteria con una proteína transportadora adecuada. Sin embargo, ha habido problemas con ese enfoque debido a las propiedades del polisacárido que encapsula N. meningitidis. Su enlace fosfodiéster puede degradarse en las condiciones necesarias para la unión del polisacárido a proteínas, e incluso después de la preparación, los glucoconjugados de los PSC nativos tienden a degradarse durante el almacenamiento.

Los fosfodiésteres normalmente son bastantes estables, pero en el polisacárido capsular de N. meningitidis, el fosfodiéster está ligado al centro anomérico de un residuo de hidrato de carbono. Así, un oxígeno del fosfodiéster también es parte de un enlace acetal, que lo hace susceptible a la escisión hidrolítica catalizada por electrófilos tales como iones ácidos o metálicos. La escisión de este enlace degrada el polisacárido en trozos más pequeños. Desafortunadamente, durante las manipulaciones requeridas para formar un glucoconjugado, o incluso en una formulación de vacuna, el PSC de N. meningitidis A está sometido a tal degradación, dificultando preparar y guardar vacunas eficaces que comprenden este PSC particular.

Una forma de hacer el enlace fosfodiéster más estable es eliminar el oxígeno entre el fósforo y el oxígeno anomérico, de manera que la porción del enlace ya no sea susceptible a la escisión por hidrólisis electrófila. El oxígeno exocíclico en el centro anomérico puede sustituirse con un átomo de carbono isóstero (CH2) , que transforma el fosfodiéster en su análogo de C-fosfonato. Esto debe producir una versión estabilizada... [Seguir leyendo]

1. Un oligosacárido que comprende una primera unidad de manosa y una segunda unidad de manosa,

en el que la primera unidad de manosa comprende un resto de espaciador en la configuración alfa en C-1, espaciador que puede conjugarse con una proteína, en el que la primera unidad de manosa está conectada a la segunda unidad de manosa mediante un enlace 1, 6 que conecta C-6 de la primera unidad con C-1 de la segunda unidad, y en el que el enlace 1, 6 comprende un fosfonato.

2. El oligosacárido de la reivindicación 1, en el que el enlace 1, 6 está en la configuración alfa.

3. El oligosacárido de la reivindicación 1 ó 2, en el que la primera unidad de manosa es un derivado de manosa

sustituido con 2-desoxi-2-aza. 15

4. El oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la segunda unidad de manosa es un derivado de manosa sustituido con 2-desoxi-2-aza.

5. El oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que cada sustituyente 2-aza presente está 20 seleccionado de NH2, NHAc y N3.

6. El oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que una tercera unidad de manosa está conectada a la segunda unidad de manosa por un enlace que comprende fósforo, y en el que el enlace conecta C-6 de la segunda unidad de manosa con C-1 de la tercera unidad de manosa.

7. El oligosacárido de la reivindicación 6, que es de fórmula:

en la que cada Az está seleccionado independientemente de NH2, NHAc y N3; Z representa el resto de espaciador que puede conjugarse con una proteína, y que puede estar en forma protegida o no protegida o que puede conjugarse con una proteína;

cada R1 es independientemente H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, o M, en la que M representa un catión; X es O o CH2; cada R3 y R4 está seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, Ac, Bn, y otro grupo protector;

y R6 es H, o un grupo protector, o un fosfato, o un enlace con una unidad de sacárido adicional.

8. El oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además una proteína que está conjugada con el oligosacárido mediante el resto de espaciador que está en la configuración alfa en C-1 de la primera unidad de manosa; en el que la proteína es una toxina bacteriana inactivada seleccionada de toxoide 55 diftérico, toxoide de pertussis, LT de E. coli, ST de E. coli, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) o toxoide tetánico, o en el que la proteína es CRM197.

9. El oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que R3 es un grupo acilo y R4 es H.

10. El oligosacárido de la reivindicación 1, que comprende la fórmula:

en la que cada Az representa un sustituyente aza; cada R3 y R4 representa independientemente H o un grupo protector; R6 representa H, un grupo protector, o un conector unido a otra unidad de sacárido; uno de W y X es O, y el otrode W y X es CH2; n es 2;

unYes=OyelotroYesOR, en el que R es H, alquilo C1-C6, o arilo C6-C12, o aril C6-C12-alquilo, o R es M, en la que M es un catión; y Z es OR', SR' o NR'2, en las que cada R' es independientemente H o un grupo alquilo, acilo, arilo, arilalquilo, heteroalquilo, heteroacilo, heteroarilo o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido;

o Z representa un conector unido a otra unidad de sacárido o el resto de espaciador conjugado con una 25 proteína.

11. El oligosacárido de la reivindicación 10, en el que W es CH2, X es O, Az es NHAc y n es 2.

12. El oligosacárido de la reivindicación 10 ó 11, en el que R es M y Z comprende -O- (CH2) n-NH-, en el que n es 2-6. 30

13. El oligosacárido de la reivindicación 1, que comprende la fórmula:

en la que cada Az representa un sustituyente aza; R1 es H, alquilo C1-C6, o arilo C6-C12, o aril C6-C12-alquilo, o R1 es M, en la que M es un catión; cada R3 y R4 representa independientemente H o un grupo protector; R6 representa un acilo C1-C6 o H;

Z representa un resto de espaciador conjugado con una proteína; y en el que p es un número entero de 1 a 20; que comprende además una proteína que está conjugada con el oligosacárido; en el que la proteína es una toxina bacteriana inactivada seleccionada de toxoide diftérico, toxoide de pertussis, LT de E. coli, ST de E. coli, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) , o toxoide tetánico.

14. Un método para preparar un oligosacárido, método que comprende:

ligar un primer resto que comprende al menos una unidad de manosa sustituida con aza mediante un enlace 1, 6 que comprende un fosfonato con un segundo resto que comprende al menos una unidad de manosa sustituida con aza,

en el que el primer resto comprende un resto de espaciador, resto de espaciador que está ligado a C-1 de una unidad de manosa en la configuración alfa.

15. El método de la reivindicación 14, en el que las unidades de manosa sustituidas con N ligadas comprenden la fórmula (1) 65

en la que cada Az representa un sustituyente aza; cada R3 y R4 representa independientemente H o un grupo protector; R6 representa H, un grupo protector, o un conector unido a otra unidad de sacárido; uno de W y X es O, y el

otrode W y X es CH2; n es 2; un Y es=O yel otro YesOR, en el que R es H, alquilo C1-C6, o arilo C6-C12, o aril C6-C12-alquilo, o R es M, en la que M es un catión monovalente; y

Z representa un resto que puede estar conjugado con una proteína, que puede estar en forma protegida.

16. El método de la reivindicación 15, que comprende además ligar la segunda unidad de manosa a un sacárido adicional formando un enlace entre el oxígeno de OR6 en la fórmula (1) y el sacárido adicional.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el sacárido adicional está ligado a la segunda unidad de manosa mediante un enlace 1, 6-alfa.

18. El método de la reivindicación 14, en el que el método es un método para sintetizar un oligosacárido de unidades de manosa ligadas en alfa, comprendiendo dicho método:

combinar una unidad de manosa que comprende la fórmula (2) , en la que R6 es acilo C1-C6 o H, y R1, R3, R4, Az y Z son como se definen en la reivindicación 10;

con un monómero de alargamiento de fórmula (3) , en el que Rx representa un grupo acilo C1-C6 y M representa H o un catión;

bajo condiciones de reacción de Mitsunobu, por el cual se obtiene un oligosacárido que comprende al menos 55 dos unidades de manosa sustituidas con 2-aza conectadas por un enlace 1, 6-alfa.

19. El método de la reivindicación 18, en el que las condiciones de reacción de Mitsunobu se mantienen durante un periodo prolongado de tiempo, por el cual se obtiene un oligosacárido de fórmula (4)

en la que p es un número entero de 1 a 20. 15

20. El método de la reivindicación 19, que comprende además conjugar el oligosacárido con una proteína; en el que la proteína es una toxina bacteriana inactivada seleccionada de toxoide diftérico, toxoide de pertussis, LT de E. coli, ST de E. coli, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) o toxoide tetánico.

21. El oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en un método que comprende administrar una cantidad eficaz de un componente de vacuna de Meningitidis A a un sujeto, proporcionando así una respuesta inmunogénica.

22. Una composición que comprende al menos un oligosacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que es tanto a) una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable; como b) una composición inmunogénica.

23. La composición de la reivindicación 22, en la que el enlace fosfonato que comprende un enlace 1, 6 se forma por

una reacción de Mitsunobu. 30

24. La composición inmunogénica de la reivindicación 22 ó 23, que comprende al menos dos oligosacáridos diferentes que son específicos para al menos dos inmunotipos meningocócicos.

25. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicacione.

2. 24, que comprende además un antígeno 35 de Streptococcus pneumoniae.

26. La composición de la reivindicación 25, que comprende además (un) antígeno (s) derivado (s) de al menos uno de los serotipos A, B, C, W135 e Y de Meningitidis.

27. La composición de la reivindicación 26, en la que dicho antígeno se deriva del serotipo C, W135 o Y de Meningitidis.