Escherichia coli productora de L-treonina y proceso para producir L-treonina usando la misma.

Una cepa de Escherichia coli productora de L-treonina en la que se sustituye un promotor de un gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) en el cromosoma por un promotor de un gen de cisteína sintasa (cysK).

Escheríchia coli productora de L-treonina y proceso para producir L-treonina usando la misma

Referencia cruzada a solicitudes de patente relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Coreana N2 enero de 28, en la Oficina de Propiedad Intelectual Coreana.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

Una o más realizaciones de la presente invención se refieren a una cepa de L-treonina con productividad de L-treonina potenciada en la que se fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) en el cromosoma por un promotor del método para producir L-treonina usando la misma.

2. Descripción de la técnica relacionada

La L-treonina es un aminoácido esencial y se usa ampliamente como aditivo para piensos de animales o como aditivo alimentario, y también se usa como materia prima para fluidos médicos o para la síntesis de fármacos. Mientras que las proteínas animales contienen una cantidad suficiente de L-treonina, la proteína vegetal es deficiente en L-treonina. Por lo tanto, es probable que la L-treonina sea deficiente en animales con dieta principalmente vegetariana, y por lo tanto, en particular, se usa ampliamente como aditivo para piensos de animales.

La L-treonina se produce principalmente mediante un proceso de fermentación que usa Escheríchia coli (E. coli) o Corynebacteríum, que se desarrolla mediante mutagénesis artificial o recombinación genética. Para producir L-treonina se usa una cepa mutante derivada de una cepa de tipo silvestre de Escheríchia coli (E. coli), Corynebactería sp., Serratia sp. o de Providencia sp. Los ejemplos de la cepa mutante incluyen una cepa resistente a análogos de aminoácidos o fármacos, y una cepa mutante auxotrófica para ácido diaminopimélico, metionina, Usina o isoleucina que también tiene resistencia a análogos de aminoácidos o a fármacos. Entre los métodos para producir L-treonina usando una cepa mutante, se divulga un método para usar un microorganismo que pertenece a la especie Escheríchia coli, que tiene fenotipos auxótrofos para el ácido diaminopimélico y la metionina, y está mutada de modo que la biosíntesis de L-treonina no se vea afectada por la inhibición por retroalimentación de treonina, en la Patente Japonesa N2 137/81.

También puede usarse un proceso de fermentación que usa una cepa recombinante en la producción de L-treonina. Por ejemplo, la Publicación Solicitud de Patente Japonesa N2 5-227977 divulga un método para producir L-treonina que usa una E. coli recombinante en la que se introduce un operón de treonina que consiste en los genes que codifican la aspartoquinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa en una forma de plásmido, y un método para producir la L-treonina usando Brevibacterium flavum productora de treonina en el que se introduce un operón de treonina derivado de E. coli (TURBA E, ef al, Agrie. Biol. Chem. 53:2269-2271, 1989).

En general, la expresión de un gen específico en un microorganismo puede potenciarse aumentando el número de copias del gen en el microorganismo. Para esto, se usa un plásmido que da un número mayor de copias para un microorganismo [Sambrook et al., Molecular Cloning, 22, 1989, 1.3-1.5]. Es decir, el número de genes puede aumentar en la misma cantidad que el número de copias del plásmido para un solo microorganismo insertando un gen diana en el plásmido cuyo número de copias puede mantenerse a un nivel alto y después transformando el microorganismo con el plásmido recombinante obtenido. Se han hecho intentos de potenciar la productividad de treonina usando este método y se ha notificado un éxito parcial (Patente de EE.UU. N2 5.538.873). Sin embargo, esta tecnología que usa un plásmido induce la expresión excesiva de un solo gen específico en la mayor parte de los casos, imponiendo de este modo una carga pesada sobre un microorganismo hospedador. Además, los plásmidos pueden perderse durante el cultivo de una cepa recombinante, disminuyendo de este modo la estabilidad del plásmido. Para abordar estos problemas del método para producir treonina usando una cepa recombinante en la cual se introduce un plásmido, se han desarrollado la adición de un antibiótico a un cultivo y métodos para usar un plásmido cuya expresión es controlable [Sambrook et al. Molecular Cloning, 22, 1989, 1.5-1.6, 1.9-1.11], En el caso de usar el plásmido cuya expresión es controlable, para aliviar la carga en un microorganismo hospedador y obtener una gran cantidad de células, durante la fase de crecimiento, se cultiva un microorganismo hospedador en condiciones en las que no ocurra la expresión de un gen diana en el plásmido, y después del crecimiento suficiente del microorganismo hospedador, se induce la expresión temporal del gen, obteniendo de este modo un material diana. Sin embargo, los métodos que usan plásmidos cuya expresión es controlable pueden usarse solamente cuando el producto génico final es una proteína o un metabolito secundario. En caso de que el producto sea un metabolito primario que se produzca al mismo tiempo en que los microorganismos empiezan a crecer, la expresión del gen diana debe inducirse durante la fase de crecimiento. De otro modo, es difícil anticipar la acumulación del metabolito primario. Dado que la treonina pertenece a uno de los metabolitos primarios, este último caso también se

1-28-231, presentada el 8 de

Escheríchia coli (E. coli) productora de sustituye un promotor del gen de gen de cisterna sintasa (cysK), y un

aplica a la treonina.

Por lo tanto, para potenciar la productividad de la treonina, que es un metabolito primario, se divulga la inserción de genes implicados en la biosíntesis de treonina en el ADN cromosómico de un microorganismo en la Patente de EE.UU. N2 5.939.37, en lugar de usar un método de introducción de un plásmido con genes relacionados con la biosíntesis de treonina en un microorganismo. Los métodos para aumentar los genes relacionados con la biosíntesis de treonina y la expresión de los mismos se han desarrollado de diversos modos, pero aún existe una necesidad para desarrollar un método para producir de un modo más económico L-treonina con un alto rendimiento.

Para aumentar el rendimiento de la producción de L-treonina, se ha llevado a cabo de manera intensiva una investigación de una ruta de biosíntesis del oxalacetato a la treonina. A este respecto, primero se pretendió inducir el flujo de carbono a lo largo de una ruta desde el fosfoenolpiruvato a oxalacetato, potenciando la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, implicada en una etapa inmediatamente anterior a la biosíntesis de L-treonina. Para esto, se estudió y se descubrió una cepa de microorganismos capaz de producir L-treonina en la que se sustituyó un promotor de un gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) del cromosoma por un promotor de un gen que codifica la cisterna sintetasa (cysK) de modo que aumentara la expresión de un gen que codifica la ppc, que es una primera enzima de la biosíntesis de L-treonina que después de la glucolisis, produjo L-treonina con alto rendimiento, completando por lo tanto la presente invención.

Sumario de la invención

Una o más de las realizaciones de la presente invención proporcionan una cepa de Escherichia coli (E. coli) capaz de producir L-treonina con alto rendimiento.

Una o más realizaciones de la presente invención también proporcionan un método para producir L-treonina usando la cepa de E. coli mediante el cual la L-treonina puede producirse de manera eficaz.

Breve descripción de los dibujos

Las anteriores y otras características y ventajas de la presente invención serán más evidentes describiendo en detalle las realizaciones ejemplares de la misma con referencia a los dibujos acompañantes en los que:

La FIG. 1 es un diagrama que ilustra un proceso para construir un vector recombinante pUC-PcysK; y la FIG. 2 es un diagrama que ¡lustra un proceso para construir un vector recombinante pUCpcysKmloxP.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un microorganismo productor de L-treonina en el que se sustituye un promotor natural de un gen (ppc) en el cromosoma por un promotor de un gen de cisteína sintetasa (cysK).

En el microorganismo productor de L-treonina, la expresión de ppc aumenta de manera que un promotor de un gen que codifica ppc, que convierte el fosfoenolpiruvato producido después de la glucolisis en oxalacetato, el material de partida de la biosíntesis de L-treonina, se sustituye por el promotor del gen cysK, y por consiguiente puede aumentar la productividad de L-treonina.

El microorganismo puede incluir una célula procariota o eucariota capaz de producir L-treonina en... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de Escherichia coli productora de L-treonina en la que se sustituye un promotor de un gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) en el cromosoma por un promotor de un gen de cisterna sintasa (cysK).

2. La cepa de Escherichia co//'de la reivindicación 1, que tiene un fenotipo auxótrofo de metionina, y resistencia a un análogo de treonina, a un análogo de lisina, a un análogo de ¡soleucina y a un análogo de metionina.

3. La cepa de Escherichia coli de la reivindicación 1, que es Escherichia coli CA331 (N2 de referencia: KCCM

191).

4. Un método para producir L-treonina, comprendiendo el método: cultivar la cepa de Escherichia coli de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y aislar la L-treonina del cultivo de la cepa de Escherichia coli.