El método para producir uno o más cepas de Saccharomyces que sean capaces de crecer con una tasa de al menos una generación cada 48 horas usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento,

comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una población genéticamente diversa de células de levadura de Saccharomyces no recombinantes; (b) cultivar las células de levadura en condiciones que permitan la combinación de ADN entre las células de levadura usando métodos no recombinantes; (c) identificar o seleccionar las células de levadura incubando las células de levadura en o sobre un medio que contenga xilosa, en el que las células identificadas o seleccionadas formen la población genéticamente diversa de células de levadura no recombinante; y (d) repetir las etapas (b) y (c) con las células de levadura identificadas o ensayadas hasta obtener una o más células de levadura una con una tasa de crecimiento de al menos una generación cada 48 horas usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento

Cepas de saccharomyces no recombinantes que crecen en xilosa.

Campo de la invención La invención se refiere a métodos para producir cepas de Saccharomyces no recombinantes, cepas de Saccharomyces, y a usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

Uno de los grupos económicos más importantes de levaduras son los del género Saccharomyces, cuyas cepas se emplean en la elaboración de cerveza, pan, vino, destilería y otras diversas industrias dependientes de levaduras. Las especies de Saccharomyces se definieron filogenéticamente por Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3:41715 432, e incluyen S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. pastorianus y S. bayanus. Saccharomyces spp. son algunos de los microorganismos más eficaces para transformar azúcares, tales como glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa, en biomasa y para fermentar estos azúcares en etanol. Como consecuencia de ello, Saccharomyces spp., y en particular Saccharomyces cerevisiae, es uno de los microorganismos más ampliamente usados en los procesos industriales. Por ejemplo, en la elaboración de cerveza y en las industrias del vino y destilería, Saccharomyces se usa para fermentar azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa y/o maltosa en etanol. En la industria del etanol combustible, se seleccionan cepas de Saccharomyces cerevisiae por su capacidad para transformar rápidamente grandes concentraciones de azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa en grandes cantidades de etanol. En la industria panificadora, se usan cepas de Saccharomyces cerevisiae para fermentar el pan fundamentalmente por su capacidad para producir dióxido de carbono a partir de

azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, y/o maltosa. Otras aplicaciones de Saccharomyces cerevisiae incluyen la producción de extractos de levadura y otros productos saporíferos y aromatizantes, fuentes de enzimas tales como invertasa, producción de diversos compuestos bioquímicos, productos intermedios, proteínas, aminoácidos, acido ribonucleico y nucleótidos, cofactores y vitaminas.

En los procesos industriales, cada año, se cultivan millones de toneladas de levadura. Por lo tanto, la capacidad de Saccharomyces para crecer en fuentes abundantes y renovables de carbono es importante en términos de producción económica de biomasa de levadura para fines industriales y para la producción económica de productos secundarios del metabolismo de la levadura. En particular, la capacidad de Saccharomyces para crecer en productos secundarios de desecho de otros procesos industriales es de valor económico y medioambiental. Por tanto, por ejemplo, la biomasa de levadura de panadería se produce a menudo a partir del crecimiento de la levadura en melaza, que es un producto de desecho de los procesos de producción de azúcar, o en jarabes ricos en glucosa y maltosa derivados de la industria de la hidrólisis del almidón.

El documento EP 0066396 describe la fermentación directa de la D-xilosa en etanol mediante un mutante de levadura que fermenta la xilosa.

El documento WO 00/04190 describe la evolución de organismos y de células completas por recombinación de secuencia recurrente.

45 Heluane et. al. (1993) Applied Microbiology & Biotechnology, 40 (1) : 98-100, describen la caracterización de híbridos obtenidos por la fusión del protoplasto, entre Pachysolen tannophilus y Saccharomyces cerevisiae.

Kuyper et. al. (2004) Ferns Yeast Research, 4 (6) : 655-664, describen modificaciones mínimas por ingeniería genética metabólicas de Saccharomyces cerevisiae para la fermentación anaerobia eficaz de la xilosa.

Volfová et. al. (1979) Folia Microbiologica 24 (2) : 157-162, describen una selección de cepas de levaduras con utilización óptima de hidrolizados de la paja.

Richard et. al. (1999) Febs Letters, 457 (1) ; páginas 135-138, describen pruebas de que el gen YLR070c de 55 Saccharomyces cerevisiae codifica una xilitol deshidrogenasa.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para producir una o más cepas de Saccharomyces que sean capaces de crecer con una tasa de crecimiento de al menos una generación cada 48 horas usando xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento tal y como se indica en las reivindicaciones. La invención también proporciona una cepa aislada de Saccharomyces no recombinante tal y como se define en las reivindicaciones así como los usos de las mismas (como se define en las reivindicaciones) . La invención también proporciona métodos para producir diversos compuestos tal y como se define en las reivindicaciones.

65 La xilosa es un ejemplo de azúcar abundante y renovable, de origen natural, disponible a partir de la biomasa de las plantas que se consideraba anteriormente que el Saccharomyces no podía utilizar. Véase por ejemplo, Barnett et. al.

'Yeasts Characteristics and Identification' 2ª edición (1990) , Cambridge University Press, que indica que la levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae no es capaz de utilizar la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento. La xilosa representa una fuente con un gran potencial para el crecimiento de levaduras y de productos de fabricación a partir de levaduras, que incluye el etanol. El uso de xilosa como fuente de azúcar para las levaduras proporcionaría ventajas económicas y medioambientales de una gran importancia. Por ejemplo, la producción del etanol combustible a partir de materiales ricos en xilosa podría ser una fuente muy importante de energía renovable.

La presente memoria descriptiva describe un método de producción de una cepa de Saccharomyces que puede crecer con una tasa de crecimiento deseada empleando xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento, que comprende:

(a) proporcionar una población genéticamente diversa de células de levadura de Saccharomyces no recombinante; 15

(b) cultivar las células de levadura en condiciones que permitan combinar ADN entre células de levadura;

(c) identificar o seleccionar las células de levadura para detectar células de levadura que hayan aumentado su tasa de crecimiento usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento;

(d) aislar una o más células de levadura que tengan la tasa de crecimiento deseada.

Generalmente, las células de levadura se cultivan en condiciones que permitan la combinación del ADN entre pares de células de levadura.

Generalmente, la tasa de crecimiento deseada es un aumento en la tasa de crecimiento con respecto al de las células de levadura de las cepas de Saccharomyces para el cual no se ha aplicado el método. Por ejemplo, cepas de Saccharomyces tales como la cepa NL67. Más generalmente, la tasa de crecimiento deseada es de al menos una generación cada 48 horas, más generalmente al menos una generación cada 24 horas.

Generalmente, las células de levadura se identifican o se seleccionan para detectar células de levadura que tengan la tasa de crecimiento deseada mediante incubación de las células de levadura en o sobre un medio que contenga xilosa. Generalmente, el medio que contiene xilosa es un medio de cultivo que contiene xilosa. El medio de cultivo puede contener xilosa como única fuente de carbono, o la xilosa puede ser una de las diversas de fuentes de carbono. Generalmente, la xilosa es la única fuente de carbono en el medio que contiene xilosa. Generalmente, el medio de cultivo que contiene xilosa es un medio mínimo mineral con xilosa. Las células de levadura se incuban generalmente en o sobre el medio que contiene xilosa durante un tiempo suficiente que permita a las células de levadura alcanzar la tasa de crecimiento deseada usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento.

En una realización, las células de levadura identificadas o seleccionadas forman la población genéticamente diversa de células de levadura no recombinante, y las etapas (b) y (c) se repiten hasta que se obtienen las células de levadura con la tasa de crecimiento deseada.

45 En una realización, la etapa (b) se realiza antes que la etapa (c) . En otra realización, la etapa (c) se realiza antes que la etapa (b) . En otra realización más, las etapas (b) y (c) se realizan de modo simultáneo.

La presente memoria descriptiva desvela un método para la producción de una cepa de Saccharomyces en un cultivo que es susceptible de conseguir una tasa de crecimiento deseada usando la xilosa como única fuente de carbono... [Seguir leyendo]

1. El método para producir uno o más cepas de Saccharomyces que sean capaces de crecer con una tasa de al menos una generación cada 48 horas usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento, 5 comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar una población genéticamente diversa de células de levadura de Saccharomyces no recombinantes;

(b) cultivar las células de levadura en condiciones que permitan la combinación de ADN entre las células de levadura usando métodos no recombinantes;

(c) identificar o seleccionar las células de levadura incubando las células de levadura en o sobre un medio que contenga xilosa, en el que las células identificadas o seleccionadas formen la población genéticamente diversa de células de levadura no recombinante; y

(d) repetir las etapas (b) y (c) con las células de levadura identificadas o ensayadas hasta obtener una o

más células de levadura una con una tasa de crecimiento de al menos una generación cada 48 horas usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de aislar a una o más células de levadura con una tasa de crecimiento de al menos una generación cada 48 horas usando la xilosa como única fuente de carbono.

3. El método de la reivindicación 1, en el que las células de levadura se incuban sobre un medio que contenga xilosa.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio que contenga xilosa contiene xilosa 25 como única fuente de carbono.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células de levadura se seleccionan incubando las células de levadura sobre un medio que contenga xilosa.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medio que contiene xilosa sea un medio mínimo de xilosa.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio que contiene xilosa es un medio

mínimo sólido que contenga xilosa.35

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células de levadura se incuban en o sobre un medio que contenga xilosa durante un periodo de tiempo suficiente para permitir crecer en xilosa a las células de levadura que no tengan una tasa de crecimiento aumentada usando la xilosa como única fuente de carbono.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la combinación de ADN entre las células de levadura sea por cruzamiento.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el cruzamiento sea por esporulación de las células de levadura y por

hibridación de la descendencia sexualmente competente. 45

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la población genéticamente diversa de células de levadura comprende la especie Saccharomyces cerevisiae.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la población de células de levadura comprende cepas de Saccharomyces de origen natural.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la población genéticamente diversa de células de levadura no recombinante comprende cepas de Saccharomyces generadas por una o más de mutagénesis química o física, fusión de protoplasto, esporulación e hibridación, citoducción.

14. Una cepa aislada de Saccharomyces no recombinante seleccionada del grupo que consiste en la cepa de Saccharomyces depositada con el número de acceso del depósito AGAL NM04/41257, una cepa de Saccharomyces no recombinante depositada con el número de acceso del depósito AGAL NM04/41258, una cepa de Saccharomyces no recombinante depositada con el número de acceso del depósito AGAL NM05/45177, una cepa de Saccharomyces no recombinante depositada con el número de acceso del depósito AGAL NM05/45178.

15. El uso de la cepa de Saccharomyces de la reivindicación 14 en la producción de biomasa de levadura.

16. El uso de la cepa de Saccharomyces de la reivindicación 14 en la producción de etanol.

65 17. Un método para convertir xilosa en biomasa de levadura, que comprende el cultivo de una cepa de Saccharomyces de la reivindicación 14, con un medio que contenga xilosa en condiciones que permitan a la cepa crecer usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento.

18. Un método para producir biomasa de levadura que comprende el crecimiento de una cepa de Saccharomyces de la reivindicación 14, sobre o en un medio que contenga xilosa en el que al menos una parte de la biomasa de 5 levadura se produce usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento.

19. Un método para producir un compuesto seleccionado del grupo que consiste en etanol, xilitol, ácido acético, enzimas, vitaminas, aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleósidos, nucleótidos, oligonucléotidos, ADN, ADN, componentes de la pared celular, glucanos, manoproteínas, lípidos, esteroles, hidratos de carbono, ácido láctico, glicerol, ácido succínico, glucógeno, trehalosa y polioles, a partir de una cepa de Saccharomyces, comprendiendo el procedimiento el cultivo de la cepa de Saccharomyces de la reivindicación 14, en un medio que contenga xilosa en condiciones que permitan la producción del compuesto; y la recuperación del compuesto producido por la cepa.

20. Un método para producir etanol que comprende las etapas de: 15

(a) incubar la cepa de la reivindicación 14, en un medio en condiciones que permitan la producción de etanol;

(b) aislar el etanol producido.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el medio es un medio que contiene xilosa y preferentemente en el que el medio que contiene xilosa comprende, además de xilosa, uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste en glucosa, fructosa, manosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, sacarosa, melibiosa, rafinosa, xilosa, melicitosa, alfa-metil glucósido, trehalosa y/o isomaltosa.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, en el que las cepas se incuban en condiciones anaerobias.

23. Un método para la producción de etanol que comprende:

(a) inocular los medios que contienen xilosa con la cepa de la reivindicación 14, a una densidad de al menos 1 x 108 levaduras por ml de medio;

(b) incubar los medios inoculados durante un tiempo suficiente que permita la producción de etanol;

(c) recuperar el etanol.

24. El método de la reivindicación 23, en el que la densidad es de al menos 5 x 108 por ml.

25. Un método para marcar una cepa de Saccharomyces deseada mediante el cual la cepa marcada presente al menos un incremento de 2 veces en su biomasa en el Ensayo T1, que comprende:

(a) cultivar la cepa deseada con una cepa de la reivindicación 14 en condiciones que permitan la combinación de ADN de las cepas;

(b) identificar o seleccionar las células de levadura para obtener un derivado de la cepa deseada que tenga una tasa de crecimiento aumentada usando la xilosa como única fuente de carbono para su crecimiento;

(c) aislar derivados de la cepa deseada de Saccharomyces que tiene una tasa de crecimiento aumentada 45 usando la xilosa como única fuente de carbono, en el que el Ensayo T1 tiene las siguientes etapas:

Etapa 1, cultivo de levadura durante 72 horas a 30 ºC en un medio de Glucosa, Extracto de 50 Levadura, Peptona Bacteriológica, solidificado con agar al 2%; Etapa 2, inocular 50 ml de caldo con la levadura de la etapa 1 en un matraz Erlenmeyer de 250 mla una Densidad Óptica a 600nm (DO600) de 0, 1 a 0, 2 unidades (DO600 a T0) , consistiendo el caldo en xilosa al 5% p/v y Base Nitrogenada de Levadura Difco sin aminoácidos al 0, 67% en agua destilada;

55 Etapa 3, incubar el matraz Erlenmeyer a 30 ºC agitando a 220 rpm; con un diámetro orbital de 10 cm. m; Etapa 4, medir la DO600 después de 48 horas de incubación en la etapa 3 (DO600 aT48hrs) ;

60 Etapa 5, calcular el aumento de biomasa usando la fórmula DO600 a T48hrs /DO600 a T0hrs.

FIGURA 1