Determinación simultánea de aneuploidía y fracción fetal.

Un método para determinar simultáneamente aneuploidía y fracción fetal en una muestra materna de sangre,

plasma o suero que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en el que la mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos son moléculas de ADN libre de células (ADNcf) y dicha fracción fetal es la fracción de dichas moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas por un feto a dicha mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, dicho método comprende:

(a) enriquecer dicha mezcla para una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos objetivo se sabe que comprende al menos un sitio polimórfico, y en donde dicho enriquecimiento comprende:

(i) amplificar específicamente dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo en una porción de dicha mezcla usando pares de cebadores cada uno capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos objetivo que comprende un sitio polimórfico en una reacción de PCR multiplex para generar un panel de sitios polimórficos amplificados que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de tal forma que al menos dos son sitios polimórficos informativos; y

(ii) combinar al menos una porción de todo el producto amplificado con al menos una porción del resto de la muestra no amplificada de la que se obtuvo la porción;

(b) secuenciar al menos una porción de la mezcla enriquecida obtenida en el paso (a), en donde dicha secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de lecturas de secuencia que se mapean para un genoma para identificar una pluralidad de etiquetas de secuencia mapeadas; y

(c) usar dicha pluralidad de etiquetas de secuencia mapeadas, determinar simultáneamente dicha fracción fetal y dicha aneuploidía, en donde:

(i) determinar dicha fracción fetal comprende:

(1) usar las etiquetas de secuencia mapeadas para identificar al menos dos sitios polimórficos informativos en dicho panel de sitios polimórficos amplificados, en donde dichos sitios polimórficos informativos se identifican por la diferencia en las secuencias alélicas y el número de etiquetas de secuencia mapeadas para cada uno de los alelos posibles en cada sitio polimórfico; y

(2) calcular la fracción fetal en base al número total de etiquetas de secuencia que mapean para el primer alelo y el número total de etiquetas de secuencia que mapean para un segundo alelo en cada uno de dichos sitios polimórficos informativos; y

(ii) determinar dicha aneuploidía comprende la cuantificación del número de etiquetas de secuencia que alinean con un cromosoma de interés, y comparar los resultados obtenidos para el cromosoma de interés con un valor límite, en donde el valor límite es un número que sirve como un límite de diagnóstico de una aneuploidía y en donde la presencia de una aneuploidía para el cromosoma de interés se identifica si el valor límite es excedido por los resultados obtenidos para el cromosoma de interés.

CAMPO DE LA INVENCION

La invención se refiere de manera general al campo de diagnósticos, y proporciona un método que es aplicable a la práctica de diagnósticos prenatales no invasivos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El diagnóstico prenatal para determinar anomalías fetales potenciales proporciona una oportunidad para el cuidado y gestión necesarios durante el embarazo, el periodo neonatal y el parto. Las técnicas de formación de imágenes como ecografía, resonancia magnética y ecocardiografía fetal son útiles para la identificación de anomalías estructurales del feto. La amniocentesis, muestra de vellosidades coriónicas y muestra de sangre fetal proporcionan células y tejidos fetales para el análisis de anomalías cromosómicas, genéticas y bioquímicas, pero son invasivas y plantean riesgo alto al embarazo.

La existencia de ADN libre de células circulante en la sangre materna (Lo et al., Lancet 350:485-487 [1997]) se está aprovechando para desarrollar procesos no invasivos que usan ácidos nucleicos fetales de una muestra de sangre periférica materna para determinar anomalías cromosómicas fetales (Fan HC y Quake SR Anal Chem 79:7576-7579 [2007]; Fan et al., Proc Natl Acad Sci 105:16266-16271 [2008]) .

Estos métodos proporcionan un cambio de paradigma en el diagnóstico prenatal, ya que podrían anunciar efectivamente el final de los procedimientos invasivos. Sin embargo, la sensibilidad de la determinación de aneuploidía fetal depende en gran medida de la fracción de ADN fetal, que se ha determinado que es <10% del ADN libre de células (ADNcf) circulante total (Lo et al., Am J Hum Genet 62:768-775 [1998]) . Dada la relativamente baja concentración de ácidos nucleicos circulantes fetales, pueden surgir resultados de falsos negativos si hay insuficiente ácido nucleico de partida para el análisis. Por consiguiente, se han desarrollado ensayos para la determinación no invasiva de la fracción de AND fetal, pro típicamente se basan en comparar el locus específico del feto (como el locus SRY en el cromosoma Y en embarazos masculinos) con los de un locus en cualquiera autosoma que es común tanto para la madre como el feto (Dahllan et al., Lancet 369:474-481 [2007]; Li et al., Clin Chem 10021011 [2004]; Fan et al., Proc Natl Acad Sci 105:16266-16271 [2008]) . Además, los ensayos usados para cuantificar la fracción fetal se realizan independientemente de los ensayos que se están desarrollando para determinar la presencia o ausencia de aneuploidías en el ADN libre de células circulante.

Los documentos Lo et al., CHEMISTRY, 2008, vol. 54, no. 3, pg. 461-466 y Chu et al., BIOINFORMATICS, 2009, vol. 25, no. 10, pg. 1244-1250 divulgan métodos en los que la secuenciación de ADN en sangre materna se usa para obtener información de la dosis de cromosoma en cachos sospechosos de aneuploidía. Las variaciones anormales en la densidad y/o número de etiquetas de secuencia para cada cromosoma bajo análisis frente a un control para el mismo cromosoma están correlacionados con la presencia de aneuploidía.

Por lo tanto, sería deseable proporcionar un ensayo prenatal que proporcione un control interno para medir la adecuación de los ácidos nucleicos fetales de entrada y evite los diagnósticos incorrectos de anomalías cromosómicas fetales.

La presente invención se refiere a composiciones y métodos que permiten la determinación simultánea de la fracción fetal y la determinación de la presencia o ausencia de aneuploidía a partir de un proceso de secuenciación de diagnóstico individual. El método permite determinar la fracción fetal de una manera independiente del género, que se basa en la cuantificación de alelos en cromosomas múltiples. El método de diagnóstico no invasivo abarca el uso de tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) que puede ser implementada en un proceso racionalizado y rentable para proporcionar diagnósticos prenatales no invasivos de aneuploidías fetales con mayor confianza.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invención se refiere a composiciones y métodos para determinar simultáneamente la presencia o ausencia de aneuploidía fetal y la cantidad relativa de ácidos nucleicos fetales en una muestra obtenida de una mujer embarazada. El método abarca el uso de tecnologías de secuenciación y explota la aparición de polimorfismos para proporcionar un proceso no invasivo racionalizado aplicable a la práctica del diagnóstico prenatal.

La invención proporciona un método para determinar simultáneamente aneuploidía y fracción fetal en una muestra de sangre, plasma o suero materno que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en donde la mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos son moléculas de ADN libre de células (ADNcf) y dicha fracción fetal es la fracción de dichas moléculas de ácidos nucleicos aportadas por un feto a

dicha mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en donde se sabe que cada uno de dichos ácidos nucleicos comprende al menos un sitio polimórficos, y en donde dicho enriquecimiento comprende: (i) amplificar específicamente dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo en una porción de dicha mezcla usando pares de cebadores cada uno capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos objetivo que comprende un sitio polimórfico en una reacción de PCR multiplex para generar un panel de sitios polimórficos amplificados que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de tal manera que al menos dos son sitios polimórficos informativos; y (ii) combinar al menos una porción o todo el producto amplificado con al menos una porción del resto de la muestra no amplificada de la que se retiró la porción; (b) secuenciar al menos una porción de la mezcla enriquecida obtenida en el paso (a) , en donde dicha secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de lecturas de secuencia que se mapean para un genoma para identificar una pluralidad de etiquetas de secuencia mapeadas; y (c) usar dicha pluralidad de etiquetas de secuencia mapeadas, determinar simultáneamente dicha fracción fetal y dicha aneuploidía, en donde: (i) determinar dicha fracción fetal comprende: (1) usar las etiquetas de secuencia mapeadas para identificar al menos dos sitios polimórficos informativos en dicho panel de sitios polimórficos amplificados, en donde dichos sitios polimórficos informativos se identifican por la diferencia en las secuencias alélicas y el número de etiquetas de secuencia mapeadas para cada uno de los posibles alelos en cada sitio polimórfico, y (2) calcular la fracción fetal en base al número total de etiquetas de secuencia que mapean para un primer alelo y el número total de etiquetas de secuencia que mapean para un segundo alelo en cada uno de dichos sitios polimórficos informativos; y (ii) determinar dicha aneuploidía comprende la cuantificación del número de etiquetas de secuencia que se alinean con un cromosoma de interés, y comparar los resultados obtenidos para el cromosoma de interés con un valor límite, en donde el valor límite es un número que sirve como un límite de diagnóstico de una aneuploidía y en donde la presencia de una aneuploidía para el cromosoma de interés se identifica si el valor límite se supera por los resultados obtenidos para el cromosoma de interés.

En una realización, se divulga un método para determinar simultáneamente aneuploidía y fracción fetal en una muestra materna que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, el método comprende: (a) enriquecer dicha mezcla para una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos; (b) secuenciar al menos una porción de la mezcla enriquecida obtenida en el paso (a) , en donde la secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de etiquetas de secuencia; y (c) en base a la secuenciación, determinar simultáneamente la fracción fetal y la presencia o ausencia de aneuploidía fetal.

En otra realización, se divulga un método para determinar simultáneamente aneuploidía y fracción fetal en una muestra materna que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, el método comprende: (a) enriquecer dicha mezcla para una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos, en donde enriquecer comprende amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos en una porción de dicha mezcla; (b) secuenciar al menos una porción de la mezcla enriquecida obtenida en el paso (a) , en donde la secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de etiquetas de secuencia; y (c) en base a la secuenciación, determinar simultáneamente la fracción fetal y la presencia o ausencia de aneuploidía fetal.

En otra realización, se... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar simultáneamente aneuploidía y fracción fetal en una muestra materna de sangre, plasma o suero que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en el que la mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos son moléculas de ADN libre de células (ADNcf) y dicha fracción fetal es la fracción de dichas moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas por un feto a dicha mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, dicho método comprende:

(a) enriquecer dicha mezcla para una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos objetivo se sabe que comprende al menos un sitio polimórfico, y en donde dicho enriquecimiento comprende:

(i) amplificar específicamente dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo en una porción de dicha mezcla usando pares de cebadores cada uno capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos objetivo que comprende un sitio polimórfico en una reacción de PCR multiplex para generar un panel de sitios polimórficos amplificados que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de tal forma que al menos dos son sitios polimórficos informativos; y

(ii) combinar al menos una porción de todo el producto amplificado con al menos una porción del resto de la muestra no amplificada de la que se obtuvo la porción;

(b) secuenciar al menos una porción de la mezcla enriquecida obtenida en el paso (a) , en donde dicha secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de lecturas de secuencia que se mapean para un genoma para identificar una pluralidad de etiquetas de secuencia mapeadas; y

(c) usar dicha pluralidad de etiquetas de secuencia mapeadas, determinar simultáneamente dicha fracción fetal y dicha aneuploidía, en donde:

(i) determinar dicha fracción fetal comprende:

(1) usar las etiquetas de secuencia mapeadas para identificar al menos dos sitios polimórficos informativos en dicho panel de sitios polimórficos amplificados, en donde dichos sitios polimórficos informativos se identifican por la diferencia en las secuencias alélicas y el número de etiquetas de secuencia mapeadas para cada uno de los alelos posibles en cada sitio polimórfico; y

(2) calcular la fracción fetal en base al número total de etiquetas de secuencia que mapean para el primer alelo y el número total de etiquetas de secuencia que mapean para un segundo alelo en cada uno de dichos sitios polimórficos informativos; y

(ii) determinar dicha aneuploidía comprende la cuantificación del número de etiquetas de secuencia que alinean con un cromosoma de interés, y comparar los resultados obtenidos para el cromosoma de interés con un valor límite, en donde el valor límite es un número que sirve como un límite de diagnóstico de una aneuploidía y en donde la presencia de una aneuploidía para el cromosoma de interés se identifica si el valor límite es excedido por los resultados obtenidos para el cromosoma de interés.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho paso de enriquecimiento (a) comprende:

(i) amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos para generar un panel de sitios polimórficos que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de tal manera que al menos tres son sitios polimórficos informativos;

(ii) amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos para generar un panel de sitios polimórficos que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de tal manera que al menos cuatro son sitios polimórficos informativos; o

(iii) amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos para generar un panel de sitios polimórficos que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de tal manera que al menos cinco son sitios polimórficos informativos.

3. El método de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en donde determinar dicha fracción fetal en el paso (c) comprende calcular la fracción fetal en base a:

(i) el número total de etiquetas de secuencia que mapean par aun primer alelo y el número total de etiquetas de secuencia que mapean para un segundo alelo para cada uno de los al menos tres alelos informativos;

(ii) el número total de etiquetas de secuencia que mapean par aun primer alelo y el número total de etiquetas de secuencia que mapean para un segundo alelo para cada uno de los menos cuatro alelos informativos; o

(iii) el número total de etiquetas de secuencia que mapean par aun primer alelo y el número total de etiquetas de secuencia que mapean para un segundo alelo para cada uno de los al menos cinco alelos informativos.

4. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, en donde dicho paso de enriquecimiento (a) comprende

amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos en una porción de una mezcla purificada de ácidos nucleicos fetales y maternos.

5. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, en donde dicho enriquecimiento comprende:

(i) preparar una primera biblioteca de secuenciación de dicha mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos;

(ii) preparar una segunda biblioteca de secuenciación de dichos ácidos nucleicos objetivo polimórficos; y

(iii) combinar al menos una porción de dicha primera biblioteca de secuenciación con al menos una porción de dicha segunda biblioteca de secuenciación.

6. El método de cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en donde dichos ácidos nucleicos objetivo polimórficos están localizados en el mismo cromosoma.

7. El método de cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en donde dichos ácidos nucleicos objetivo polimórficos están localizados en cromosomas diferentes.

8. El método de cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en donde cada uno de dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos comprende al menos un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) .

9. El método de la Reivindicación 8, en donde el SNP es un SNP individual.

10. El método de la Reivindicación 9, en donde dicho al menos un SNP es un SNP individual seleccionado de cada uno de dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos que comprende un SNP seleccionado de rs560681, rs1109037, rs9866013, rs13182883, rs13218440, rs7041158, rs740598, rs10773760, rs4530059, rs7205345, rs8078417, rs576261, rs2567608, rs430046, rs9951171, rs338882, rs10776839, rs9905977, rs1277284, rs258684, rs1347696, rs508485, rs9788670, rs8137254, rs3143, rs2182957, rs3739005 y rs530022.

11. El método de la Reivindicación 8, en donde el SNP es un SNP en tándem.

12. El método de la Reivindicación 11, en donde dicho al menos un SNP es un SNP en tándem seleccionado de los conjuntos de SNPs en tándem rs7277033-rs2110153; rs2822654-rs1882882; rs368657-rs376635; rs2822731rs2822732; rs1475881-rs7275487; rs1735976-rs2827016; rs447340-rs2824097; rs418989-rs13047336; rs987980rs987981; rs4143392-rs4143391; rs1691324-rs13050434; rs11909758-rs9980111; rs2826842-rs232414; rs1980969-rs1980970; rs9978999-rs9979175; rs1034346-rs12481852; rs7509629-rs2828358; rs4817013-rs7277036; rs9981121-rs2829696; rs455921-rs2898102; rs2898102-rs458848; rs961301-rs2830208; rs2174536-rs458076; rs11088023-rs11088024; rs1011734-rs1011733; rs2831244-rs9789838; rs8132769-rs2831440; rs8134080rs2831524; rs4817219-rs4817220; rs2250911-rs2250997; rs2831899-rs2831900; rs2831902-rs2831903; rs11088086-rs2251447; rs2832040-rs11088088; rs2832141-rs2246777; rs2832959-rs9980934; rs2833734rs2833735; rs933121-rs933122; rs2834140-rs12626953; rs2834485-rs3453; rs9974986-rs2834703; rs2776266rs2835001; rs1984014-rs1984015; rs7281674-rs2835316; rs13047304-rs13047322; rs2835545-rs4816551; rs2835735-rs2835736; rs13047608-rs2835826; rs2836550-rs2212596; rs2836660-rs2836661; rs465612-rs8131220; rs9980072-rs8130031; rs418359-rs2836926; rs7278447-rs7278858; rs385787-rs367001; rs367001-rs386095; rs2837296-rs2837297; y rs2837381-rs4816672.

13. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde cada uno de dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo comprende al menos una repetición corta en tándem (STR) .

14. El método de la Reivindicación 13, en donde cada uno de dicha pluralidad de ácidos nucleicos objetivo polimórficos es una STR seleccionada de CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, Penta D, Penta E, D22S1045, D20S1082, D20S482, D18S853, D17S1301, D17S974, D14S1434, D12ATA63, D11S4463, D10S1435, D10S1248, D9S2157, D9S1122, D8S1115, D6S1017, D6S474, D5S2500, D4S2408, D4S2364, D3S4529, D3S3053, D2S1776, D2S441, D1S1677, D1S1627 y D1GATA113.

15. El método de la Reivindicación 13, en donde dicha al menos una STR es menor de alrededor de 300 pares de bases.

16. El método de cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en donde dicha secuenciación:

(i) es secuenciación de próxima generación (NGS) ;

(ii) es secuenciación masivamente paralela usando secuenciación por síntesis con terminadores de colorante reversibles;

(iii) es secuenciación por ligadura;

(iv) comprende una amplificación; o

(v) es secuenciación de moléculas individuales.

17. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-16, en donde dicha aneuploidía es una aneuploidía cromosómica completa; preferiblemente una aneuploidía elegida de trisomía 8, trisomía 13, trisomía 15, trisomía 16, trisomía 18, trisomía 21, trisomía 22, monosomía X, XXX, XXY y XYY.

18. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-16, en donde dicha aneuploidía es una aneuploidía cromosómica parcial.