Compuestos de hormonas de crecimiento estables.

Un compuesto de hormona de crecimiento que comprende un enlace disulfuro adicional en comparación con hGH definida por SEQ ID No. 1.

Compuestos de hormonas de crecimiento estables Campo de ¡a invención

La presente invención se refiere a compuestos de hormonas de crecimiento (GH, del inglés "growth hormone") estables, resistentes a la degradación proteolítlca.

Antecedentes de ia invención

La hormona de crecimiento (GH) es una hormona polipeptídlca secretada por la glándula pituitaria anterior en los mamíferos. Dependiendo de las especies, la GH es una proteína compuesta de aproximadamente 190 residuos de aminoácidos que se corresponden a un peso molecular de aproximadamente 22 kDa. GH se une a receptores de la superficie celular y lleva a cabo la señalización a través de los mismos, los receptores de GH (GHR). GH tiene un papel clave en la promoción del crecimiento, el mantenimiento de una composición corporal normal, el anabolismo y el metabolismo de lípidos. También tiene efectos directos sobre el metabolismo Intermedio, tales como una disminución de la captación de glucosa, un aumento de la lipólisis, un aumento de la captación de aminoácidos y la síntesis de proteínas. La hormona también ejerce efectos sobre otros tejidos, incluyendo el tejido adiposo, hígado, Intestino, riñón, esqueleto, tejido conectivo y muscular. La hGH recombinante ha sido producida y está comercializada comcx por ejemplo: Genotropin^ (Pharmacia Upjohn), Nutropin^yProtropin^(Genentech), Humatrope^(EI¡ Lilly), Serostimr (Serono), Norditropin (Novo Nordlsk), Omnitrope (Sandoz), Nutropin Depot (Genentech y Alkermes). Además, un análogo con un residuo de metlonlna adicional en el extremo N-terminal también se comercializa como, por ejemplo: Somatonorm^ (Pharmacia Upjohn/Pflzer).

La GH comparte una topología común con los otros miembros de la familia de proteínas de GH, prolactlna (PRL) y lactógeno placentarlo (LP). La GH se clasifica como una proteína de un haz de cuatro hélices (Figura 1) que presenta una topología de "arrlba-arrlba-abajo-abajo", con dos enlaces disulfuro conservados. Específicamente, la GH humana de tipo silvestre (hGH) está compuesta de 191 residuos de aminoácidos y tiene cuatro residuos de cisterna en las posiciones 53, 165, 182 y 189, que estabilizan la estructura tridimensional de la proteína mediante la formación de dos enlaces disulfuro Intramoleculares que conectan C53 con C165 y C182 con C189, respectivamente (Figura 1). La estructura de la hGH se ha determinado experimentalmente por cristalografía de rayos X en la forma libre (Chantalet L. et al., (1995) Proteln and Peptide Letters 3, 333-340) y en forma de complejo con su proteína de unión (el dominio extracelular del GHR humano (hGHR)) (Devos, A, M. et al., (1992) Science 255, 306-312). Estas estructuras han sido depositadas en el Protein Data Bank (PDB) y están a disposición del público (códigos de acceso al PDB, 1 HGU y 1 HWG, respectivamente). Por lo tanto, a partir de las estructuras de hGH publicadas, se pueden identificar residuos importantes para la unión de hGH a hGHR. Además, las propiedades dinámicas de hGH han sido estudiadas por espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (Kasimova M R. et al. J. Mol. Biol. (2002) 318, 679-695). Combinando los datos de rayos X y de RMN se pueden distinguir regiones de hGH que están bien estructuradas y bien definidas, de regiones que están menos estructuradas y son menos dinámicas. Se espera que las regiones menos estructuradas y dinámicas de hGH sean particularmente susceptibles a una escisión prote- olítica, y una estabilización adecuada de tales regiones conduciría a una mejor estabilidad proteolítica incrementada.

hGH ha sido objeto de numerosas mutagénesis en intentos de producir análogos de hGH con propiedades químicas o biológicas deseadas. Específicamente, se han descrito mutantes de cisterna para varios fines.

El documento US 2003/0162949 describe variantes de cisterna de miembros de la familia de supergenes de GH. Se proporciona un método general para la creación de conjugados biológicamente activos, específicos del sitio, de estas proteínas. El método implica la adición de residuos de cisterna a regiones no esenciales de las proteínas, o sustituir residuos de cisterna por aminoácidos no esenciales en las proteínas usando mutagénesis dirigida al sitio y luego acoplar covalentemente un polímero que reacciona con cisterna u otro tipo de resto reactivo con cisterna, a las proteínas a través del residuo de cisterna añadido

El documento WO 02/055532 describe mutantes de hGH modificados genéticamente que tienen al menos un resto no polipeptídico fijado covalentemente, en particular mutantes de hGH en donde un residuo de cisterna introducido se utilizó para la pegilación.

El documento US 5.951.972 describe proteínas y polipéptidos de mamífero y ser humano naturales y recombinantes derivatizados, fisiológicamente activos en los que al menos un residuo de cisterna de origen natural o incorporado dentro de la proteína, se derivatiza con diversos sustituyentes.

La escisión proteolítica de la hGH se ha estudiado en detalle. El bucle largo formado por los residuos 128 a 154 tiene sitios de escisión putativos para varias proteasas, tales como trombina, plasmina, colagenasa, subtilisina y proteasas de serina de tipo quimotripsina. Por consiguiente, esta parte de la hGH ha mostrado ser particularmente susceptible a la escisión proteolítica (Lewis, U.J. Ann. Rev. Physiol. (1984) 46, 33-42). Las enzimas que se han descrito porque degradan la hGH, incluyen trombina, plasmina, subtilisina, proteinasas de serina de tipo quimotripsina y calicreínas.

La degradación de la hGH en el tejido de rata ha sido Investigada (Garcia-Barros et al. J. Endochnol. Invest. (2000) 23, 748-754).

Se encontró ¡nicialmente que proteasas de la glándula tiroides de rata de tipo quimotripsina, que favorecen la escisión en residuos de aminoácidos voluminosos y lipofílicos, escindían el enlace peptídico entre Y143 y S144, dando como resultado una molécula de dos cadenas, seguida de la escisión entre Y42 y S43, que liberaba el péptido N- terminal F1-Y42. El bucle de división en la molécula de dos cadenas se procesa adicionalmente mediante escisión entre F146 y D147 por proteasas de tipo quimotripsina y adlclonalmente por la acción de carboxipeptidasas.

Se han descrito varios métodos para producir análogos de hGH estabilizados frente a la degradación proteolítica.

Alam et al., J. Blotech. 65, 183-190 (1998) diseñaron mutantes de hGH resistentes a la trombina y la plasmina mediante mutaciones puntuales específicas. La trombina escinde la hGH específicamente entre R134 y T135, y el muíante doble R134D, T135P produjo una variante de hGH resistente a la escisión con trombina, y el muíante triple R134D, T135P, K140A dio como resultado una resistencia a la plasmina. Además, el último muíante de hGH era resistente a la proteollsls con plasma humano durante un período de 7 días.

El documento EP534568 describe mutantes de hGH estabilizados frente a la degradación proteolítica mediante la mutación de R134 a alanina, leuclna, treonlna, fenllalanlna, prollna o hlstldina.

El documento W02004022593/Naut¡lus describe métodos generales de evolución dirigida, con rendimiento elevado para producir cltoclnas modificadas, Incluyendo variantes de GH, con mayor estabilidad proteolítica.

El documento W02006048777/Naut¡lus describe específicamente análogos de hGH modificados con mayor estabilidad proteolítica. Los análogos contienen de una a cinco mutaciones en las posiciones 1-55, 57, 58, 60-63, 67-87, 89- 91, 93, 95-100, 102-128, 131-132, 135-139, 141, 142, 144, 148-182, 184, 185 y 187-191. La introducción de residuos de cisterna puede conducir potencialmente a la formación de dímeros enlazados con disulfuro no deseados y en el documento W02006048777 la sustitución de residuos de aminoácidos con clsteína se excluye específicamente del alcance; en el documento W02006048777 (pág. 65) se afirma: "La sustitución de aminoácidos con residuos de cisterna se evita explícitamente ya que este cambio podría conducir potenclalmente a la formación de enlaces disulfuro ¡ntermoleculares".

Existe una necesidad evidente de desarrollar compuestos de hGH que sean resistentes a la degradación proteolítica. Tales compuestos estabilizados deben mostrar una mayor estabilidad frente a la escisión proteolítica, a la vez que conservan las propiedades biológicas deseadas de hGH. Tales moléculas de GH tendrían una estabilidad incrementada, un aclaramiento más lento y/o una semlvlda /n v/vo prolongada.

Además los agentes terapéuticos de proteínas se tienen que administrar generalmente por vía intravenosa o subcutánea, ya que normalmente no están suficientemente disponibles por vía oral. La baja biodisponibilidad oral de las proteínas... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de hormona de crecimiento que comprende un enlace disulfuro adicional en comparación con hGH definida por SEQ ID No. 1.

2. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 1, en donde la secuencia de polipéptidos de la hormona de crecimiento es al menos 80% Idéntica a hGH definida por SEQ ID No. 1.

3. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 1, en donde la secuencia de polipéptidos de la hormona de crecimiento es al menos 95% Idéntica a hGH definida por SEQ ID No. 1.

4. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto de hormona de crecimiento comprende un enlace disulfuro adicional entre un segmento de bucle y un segmento de hélice o dentro de un segmento de bucle o entre segmentos de bucle o entre segmentos de hélice.

5. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto comprende al menos una pareja de mutaciones correspondiente a R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26/V102C, D26/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C y/o V185C/S188C en SEQ ID No. 1.

6. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 5, en donde el compuesto comprende al

menos una pareja de mutaciones correspondiente a A17C/E174C, H21C/M170C, D26/V102C, D26/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C y/o

R94C/D107C en SEQ ID No. 1

7. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el compuesto de hormona de crecimiento comprende un enlace disulfuro adicional en donde al menos una de las cisternas está presente en el bucle 3 (L3) que se corresponde a AA 128-154 en SEQ ID No. 1.

8. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 7, en donde el compuesto de hormona de crecimiento comprende un enlace disulfuro adicional en donde al menos una de las cisternas está presente en una reglón correspondiente a AA 135-148 en SEQ ID No. 1.

9. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 7, en donde el compuesto comprende al menos una pareja de mutaciones correspondiente a F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C y/o F92C/T148C en SEQ ID No. 1.

10. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 7, en donde el compuesto de hormona de crecimiento comprende un enlace disulfuro adicional que conecta L3 con la hélice 2 (H2) o el bucle 1 (L1).

11. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 10, en donde el compuesto comprende un enlace disulfuro adicional que conecta un residuo de aminoácidos correspondiente a AA84 o AA85 en H2 con un aminoácido correspondiente a AA143 o AA144 en L3 de SEQ ID No.1.

12. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto de hormona de crecimiento está estabilizado frente a la degradación con proteasa(s).

13. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 12, en donde la proteasa es una proteasa digestiva.

14. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 13, en donde la proteasa digestiva se selecciona a partir de: pepsina, tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa y elastasa.

15. El compuesto de hormona de crecimiento según la reivindicación 12, en donde el polipéptido comprende al menos una pareja de mutaciones correspondiente a H21/M170, D26/V102C, D26/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/F148C y/o R94C/D107C en SEQ ID No.1.

16. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende exactamente dos cisternas adicionales en comparación con la hormona de crecimiento humana tal y como se define en SEQ ID No. 1.

17. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde

el compuesto de hormona de crecimiento es una proteina de fusión.

18. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto de hormona de crecimiento está modificado químicamente.

19. El compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde 5 el compuesto de hormona de crecimiento está modificado químicamente a través de restos que se fijan a las cadenas laterales o a la cadena principal del compuesto de hormona de crecimiento, tales como PEGs, carbohidratos, aglutinantes de albúmina, ácidos grasos, cadenas de alquilo, grupos llpófllos, vitaminas, ácidos billares o espaciadores.

20. Un método para preparar un compuesto de hormona de crecimiento con una estabilidad Incrementada 10 frente a la degradación proteolítica, en donde el método comprende una etapa de

a. introducción de enlace(s) disulfuro adicional(es) en hGH tal y como se define en SEQ ID No. 1.

21. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de hormona de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y un(unos) vehiculo(s) farmacéuticamente aceptable(s).

22. La composición farmacéutica según la reivindicación 21, en donde la composición es para administración 15 oral.

23. Un compuesto según las reivindicaciones 1 a 19, para uso como medicamento.

24. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para uso en el tratamiento de enfermedades o estados en donde el paciente se beneficiará de un Incremento de la cantidad de hormona de crecimiento circulante.

20 25. Uso de un compuesto según las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento para el

tratamiento de enfermedades o estados en donde el paciente se beneficiará de un incremento de la cantidad de hormona de crecimiento circulante.

26. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para uso en el tratamiento de una carencia de hormona de crecimiento (GHD); síndrome de Turner; sindrome de Prader-Willi (SPW); sindrome de Noonan;

25 síndrome de Down; enfermedad renal crónica, artritis reumatoide juvenil; flbrosls quística, infección por VIH en niños que reciben tratamiento TARGA (niños VIH/HALS); niños nacidos pequeños para su edad gestacional (SGA); poca estatura en niños con muy bajo peso al nacer (VLBW) pero SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondro- plasia; poca estatura idiopàtica (ISS); GHD en adultos; fracturas en huesos largos o de los mismos, tales como tibia, peroné, fémur, húmero, radio, cùbito, clavícula, metacarpo, metatarso y dedos; fracturas en huesos esponjosos o de 30 los mismos, tales como el cráneo, la base de la mano y la base de los pies; pacientes después de una cirugía del tendón o del ligamento, por ejemplo, de la mano, la rodilla o el hombro; pacientes que tienen o que están experimentando una osteogénesis por distracción; pacientes después de un reemplazo de cadera o de disco, reparación del menisco, fusiones espinales o fijación de prótesis, como en la rodilla, cadera, hombro, codo, muñeca o mandíbula; pacientes en los que se ha fijado material osteosintético, tal como clavos, tornillos y placas; pacientes con falta de 35 unión o mala unión de las fracturas; pacientes después de una osteotomía, por ejemplo, de la tibia o el primer dedo del pie; pacientes después del implante de un injerto; degeneración del cartílago articular en la rodilla causado por trauma o artritis; osteoporosis en pacientes con síndrome de Turner; osteoporosis en hombres; pacientes adultos con diálisis crónica (APCD); enfermedad cardiovascular asociada a una malnutrición en APCD; inversión de la caquexia en APCD; cáncer en APCD; enfermedad pulmonar obstructiva crónica en APCD; VIH en APCD; ancianos con 40 APCD; enfermedad hepática crónica en APCD, síndrome de fatiga en APCD; enfermedad de Chron; insuficiencia hepática; hombres con infecciones por VIH; síndrome de intestino corto; obesidad central; síndrome de lipodistrofia asociado a VIH (HALS); infertilidad masculina; pacientes después de una cirugía mayor electiva, desintoxicación de alcohol/drogas o trauma neurològico; envejecimiento; ancianos débiles; osteoartritis; cartílago dañado traumáticamente; disfunción eréctil; fibromialgia; trastornos de la memoria; depresión; lesión cerebral traumática; hemorragia 45 subaracnoidea; muy bajo peso al nacer; síndrome metabòlico; miopatia por glucocorticoides; o baja estatura debido a un tratamiento con glucocorticoides en niños.

27. Uso de un compuesto según las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una carencia de hormona de crecimiento (GHD); síndrome de Turner; síndrome de Prader-Willi (SPW); síndrome de Noonan; síndrome de Down; enfermedad renal crónica, artritis reumatoide juvenil; fibrosis quís-

50 tica, infección por VIH en niños que reciben tratamiento TARGA (niños VIH/HALS); niños nacidos pequeños para su edad gestacional (SGA); poca estatura en niños con muy bajo peso al nacer (VLBW) pero SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondroplasia; poca estatura idiopàtica (ISS); GHD en adultos; fracturas en huesos largos o de los mismos, tales como tibia, peroné, fémur, húmero, radio, cùbito, clavícula, metacarpo, metatarso y dedos; fracturas en huesos esponjosos o de los mismos, tales como el cráneo, la base de la mano y la base de los pies; pacien- 55 tes después de una cirugía del tendón o del ligamento, por ejemplo, de la mano, la rodilla o el hombro; pacientes que tienen o que están experimentando una osteogénesis por distracción; pacientes después de un reemplazo de cadera o de disco, reparación del menisco, fusiones espinales o fijación de prótesis, como en la rodilla, cadera, hombro,

codo, muñeca o mandíbula; pacientes en los que se ha fijado material osteoslntétlco, tal como clavos, tornillos y placas; pacientes con falta de unión o mala unión de las fracturas; pacientes después de una osteotomía, por ejemplo, de la tibia o el primer dedo del pie; pacientes después del Implante de un Injerto; degeneración del cartílago articular en la rodilla causado por trauma o artritis; osteoporosls en pacientes con síndrome de Turner; osteoporosls 5 en hombres; pacientes adultos con diálisis crónica (APCD); enfermedad cardiovascular asociada a una malnutrlclón en APCD; Inversión de la caquexia en APCD; cáncer en APCD; enfermedad pulmonar obstructiva crónica en APCD; VIH en APCD; ancianos con APCD; enfermedad hepática crónica en APCD, síndrome de fatiga en APCD; enfermedad de Chron; Insuficiencia hepática; hombres con Infecciones por VIH; síndrome de Intestino corto; obesidad central; síndrome de llpodlstrofla asociado a VIH (HALS); Infertilidad masculina; pacientes después de una cirugía mayor 10 electiva, deslntoxlcaclón de alcohol/drogas o trauma neurològico; envejecimiento; ancianos débiles; osteoartrltls; cartílago dañado traumáticamente; disfunción eréctll; flbromlalgla; trastornos de la memoria; depresión; lesión cerebral traumática; hemorragia subaracnoldea; muy bajo peso al nacer; síndrome metabòlico; miopatia por glucocortl- coldes; o baja estatura debido a un tratamiento con glucocortlcoldes en niños.