Canalrodopsina 2 mutante.

Un canal iónico inducible por luz, en donde el canal iónico inducible por luz comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-309 de la SEQ ID NO:

1 (CHOP-2), y que comprende una sustitución en una posición correspondiente a L132 en la SEQ ID NO: 1, cuya sustitución aumenta la polaridad del canal, y en donde la conductividad del calcio de dicho canal iónico inducible por la luz está aumentada al menos dos veces en comparación con CHOP-2 WT, como se determina por formación de imágenes con Fura-2 en células HEK293.

Canalrodopsina 2 mutante La invención se refiere a canalrodopsinas mutantes que tienen propiedades mejoradas, a construcciones de ácidos nucleicos que las codifican, a vectores de expresión que llevan la construcción de ácidos nucleicos, a células que comprenden dicha construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión y a sus usos respectivos, tal como se definen en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención El canal catiónico rectificado internamente, regulado por luz, la canalrodopsina-2 (ChR2) se ha convertido en una herramienta preferida para la activación impulsada por luz de las neuronas tanto in vitro como in vivo1-4. Aunque la ChR2 de tipo natural (en lo sucesivo abreviadamente ChR2 WT, por la expresión inglesa Wild-Type) se puede emplear para la despolarización inducida por luz, hay una búsqueda en curso de mutantes de ChR2 con una mayor sensibilidad a la luz para potenciales aplicaciones clínicas futuras (documento WO 03/084994 y 5-7) . Una mayor eficacia permitiría la despolarización de las capas de células distantes de la fuente de luz aplicada a pesar de la baja transmitancia óptica de, por ejemplo, el tejido cerebral. Un aumento en la sensibilidad a la luz también resolvería el problema del potencial daño celular bajo iluminación continua, debido a las altas intensidades de la luz azul necesarias para la activación completa de la ChR2 WT (1018-1019 fotones s-1 cm-2 a 480 nm) . Las variantes con mayor sensibilidad a la luz también son cruciales para la investigación relacionada con la recuperación de la visión 8, 9. A nivel de proteínas, una mayor eficacia de la luz sólo se puede lograr aumentando la duración del estado abierto y/o elevando la conductancia unitaria del canal, ya que la sensibilidad a la luz per se sólo se puede mejorar marginalmente debido a la naturaleza del retinal cromóforo ChR2. Investigaciones anteriores han demostrado que las mutaciones en las posiciones C128 y D156 en las hélices 3 y 4, respectivamente, dieron como resultado una cinética de los canales notablemente más lenta con duraciones del estado abierto de hasta 30 minutos y más, proporcionando una sensibilidad a la luz 500 veces mayor o incluso más 5, 6. Estos mutantes en C128 y D156 se pueden desconectar por luz roja a duraciones del estado abierto variables. A pesar de su superior sensibilidad a la luz, su cinética de cierre lento sigue siendo un factor limitante para su aplicabilidad.

Por consiguiente, existe todavía la necesidad de canales catiónicos inducibles por luz que presenten una mayor sensibilidad a la luz y una cinética de respuesta más rápida.

Sumario de la invención Puesto que se sabe que el potencial de superficie de la membrana interna de las células está fuertemente influenciado por Ca++, la modificación de los niveles de Ca++ intracelular de las submembranas dará lugar a la despolarización de la membrana y en las neuronas a la activación de los canales de Na+ regulados por voltaje. Por lo tanto, los inventores plantearon la hipótesis de que la sensibilidad a la luz de una neurona se puede aumentar indirectamente elevando el potencial de superficie de su membrana interna vía la afluencia de Ca++. Los inventores encontraron sorprendentemente un mutante de ChR2 con un permeabilidad mejorada al Ca++, en lo sucesivo denominada canalrodopsina translocadora del Ca (abreviadamente en lo sucesivo CatCh por la expresión inglesa Calcium translocating Channelrhodopsin) . En comparación con la ChR2 WT, la CatCh tiene una permeabilidad al Ca++ cuatro veces mayor, una sensibilidad a la luz 70 veces mayor y una cinética de respuesta más rápida cuando se expresa en las neuronas del hipocampo. Se demuestra que la mayor sensibilidad a la luz y la cinética rápida resultan de la afluencia de Ca++ regulada por luz relativamente alta, lo que eleva el potencial de superficie de la membrana interna y activa los canales de potasio (BK) de gran conductancia activados por Ca++. Un aumento en [Ca++]i eleva el potencial de la superficie interna, lo que facilita la activación de los canales de Na+ regulados por voltaje y aumenta indirectamente la sensibilidad a la luz. La repolarización que sigue a la estimulación por luz está marcadamente acelerada por la activación del canal BK dependiente de Ca++. La CatCh es un ejemplo de un nuevo principio por el cual los canales regulados por luz pueden ser modificados para aumentar la sensibilidad a la luz de la estimulación neuronal. Sus características, tales como el desencadenamiento de potenciales de acción precisos y rápidos requiriendo al mismo tiempo bajas intensidades de luz para su activación, abren el camino al uso de los canales regulados por luz en aplicaciones clínicas.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un canal iónico inducible por luz, en el que el canal iónico inducible por luz comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-309 de SEQ ID NO: 1 (CHOP-2) y que comprende una mutación en una posición correspondiente a L132 en la SEQ ID NO: 1, tal como se define adicionalmente en las reivindicaciones.

En un segundo aspecto semejante, la invención también se refiere a una canalrodopsina, que comprende el canal iónico inducible por luz de acuerdo con el primer aspecto y un retinal o derivado de retinal.

Además, en un tercer aspecto, la invención proporciona una construcción de ácidos nucleicos, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el canal iónico inducible por luz de acuerdo con el primer aspecto. En otro aspecto más, la invención proporciona un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el canal iónico inducible por luz de acuerdo con el primer aspecto o la construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con el tercer aspecto.

Además, se proporciona una célula que comprende la canalrodopsina de acuerdo con el segundo aspecto, la construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con el tercer aspecto o el vector de expresión de acuerdo con el cuarto 5 aspecto.

Además, la invención se refiere al uso como medicamento del canal iónico inducible por luz de acuerdo con el primer aspecto, la canalrodopsina del segundo aspecto, la construcción de ácidos nucleicos o el vector de expresión de acuerdo con la invención y la célula de acuerdo con la invención. En particular, se contempla un uso del vector de expresión de acuerdo con la invención en terapia génica.

Más específicamente, se contempla el uso del canal iónico inducible por luz, la canalrodopsina, la construcción de ácidos nucleicos, el vector de expresión o la célula de acuerdo con la invención en el tratamiento de la ceguera o de visión reducida.

En otro aspecto más, la invención proporciona el uso del canal iónico inducible por luz de acuerdo con el primer aspecto, que tiene, además, treonina, serina o alanina en una posición correspondiente a la posición 128 de la SEQ

ID NO: 1; y/o alanina en una posición correspondiente a la posición 156 de la SEQ ID NO: 1, en la ablación de células cancerosas.

En un aspecto final, la invención se refiere al uso de un canal iónico inducible por luz de acuerdo con el primer aspecto, o a una canalrodopsina de acuerdo con el segundo aspecto, o a una célula de acuerdo con la invención en un cribado de alto rendimiento.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas En un primer aspecto, la invención se refiere a un canal iónico inducible por luz, en el que el canal iónico inducible por luz comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-309 de la SEQ ID NO : 1 (CHOP-2) , más preferiblemente con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-315 de la SEQ ID NO: 1, o incluso con la secuencia de aminoáci

dos mostrada en las posiciones 1-737 de la SEQ ID NO: 1, y el cual comprende una mutación en una posición correspondiente a L132 en la SEQ ID NO: 1.

La CHOP2 de tipo natural tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

El canal iónico inducible por luz de la invención es una proteína de membrana con al menos 5 hélices transmembranales, que es capaz de unirse a un polieno sensible a la luz. Son preferibles las proteínas transmembranales con 6 o 7 hélices transmembranales. Sin embargo, también están cubiertas por la invención las proteínas transmembranales con más de 7 hélices, por ejemplo 8, 9 o 10 hélices transmembranales. Además, la invención abarca proteínas 35 transmembranales que además de la parte transmembranal incluyen secuencias C-terminales y/o N-terminales, en donde las secuencias C-terminales pueden extenderse en el... [Seguir leyendo]

1. Un canal iónico inducible por luz, en donde el canal iónico inducible por luz comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-309 de la SEQ ID NO: 1 (CHOP-2) , y que comprende una sustitución en una posición correspondiente a L132 en la SEQ ID NO: 1, cuya sustitución aumenta la polaridad del canal, y en donde la conductividad del calcio de dicho canal iónico inducible por la luz está aumentada al menos dos veces en comparación con CHOP-2 WT, como se determina por formación de imágenes con Fura-2 en células HEK293.

2. El canal iónico inducible por luz de la reivindicación 1, en donde el canal iónico inducible por luz comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-309 de la SEQ ID NO: 1 (CHOP2) , excepto por una sustitución en la posición L132, en donde la sustitución aumenta la polaridad de la canal.

3. El canal iónico inducible por luz de la reivindicación 1 o 2, en donde la sustitución se selecciona de L132C, L132S, L132E, L132D y L132T, en donde preferiblemente la sustitución es L132C.

4. El canal iónico inducible por luz de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:

(a) la sensibilidad a la luz está aumentada en más de 5 veces, preferiblemente en más de 10 veces, más preferiblemente en más de 20 veces, tal como 30 veces, incluso más preferiblemente en más de 40 veces, tal como 50 veces, y lo más preferiblemente en más de 60 veces, o incluso en más de 70 veces, en comparación con la de CHOP-2 WT en las neuronas del hipocampo; y/o

(b) la conductividad del calcio está aumentada al menos tres veces, más preferiblemente al menos cuatro veces en comparación con CHOP-2 WT, como se determina por formación de imágenes con Fura-2 en células HEK293; y/o

(c) la frecuencia de estimulación está aumentada al menos 1, 5 veces, más preferiblemente 2 veces o incluso más preferiblemente 2, 5 veces, en comparación con CHOP-2 WT como se determina por sus registros electrofisiológicos de células completas en neuronas del hipocampo.

5. El canal iónico inducible por luz de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el canal iónico inducible por luz comprende adicionalmente al menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos: ácido aspártico en una posición correspondiente a la posición 253 de la SEQ ID NO: 1; lisina en una posición correspondiente a la posición 257 de la SEQ ID NO: 1; triptófano en una posición correspondiente a la posición 260 de la SEQ ID NO: 1; ácido glutámico en una posición correspondiente a la posición 123 de la SEQ ID NO: 1; histidina o arginina, preferiblemente arginina, en una posición correspondiente a la posición 134 de la SEQ ID NO: 1; treonina, serina o alanina en una posición correspondiente a la posición 128 de la SEQ ID NO: 1; y/o alanina en una posición correspondiente a la posición 156 de la SEQ ID NO: 1.

6. El canal iónico inducible por luz de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el canal iónico inducible por luz comprende el resto de consenso L (I) DxxxKxxW (F, Y) .

7. Una canalrodopsina, que comprende el canal iónico inducible por luz de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 y un retinal o un derivado de retinal, en donde preferiblemente el derivado de retinal se selecciona del grupo que consiste en 3, 4-deshidroretinal, 13-etilretinal, 9-dm-retinal , 3-hidroxiretinal, 4-hidroxiretinal, naftilretinal; 3, 7, 11-trimetil- dodeca-2, 4, 6, 8, 10-pentaenal; 3, 7-dimetil-deca-2, 4, 6, 8-tetraenal; 3, 7-dimetil-octa-2, 4, 6-trienal; y retinales con la rotación 6-7 bloqueada, retinales con la rotación 8-9 bloqueada y retinales con la rotación 1011 bloqueada.

8. Una construcción de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el canal iónico inducible por luz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el canal iónico inducible por luz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, en donde preferiblemente el vector es adecuado para terapia génica, en donde en particular el vector es adecuado para transferencia de genes mediada por virus.

10. Una célula que comprende la canalrodopsina de acuerdo con la reivindicación 7, la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9.

11. La célula de la reivindicación 10, en donde la célula es una célula de mamífero o una célula de insecto, o en donde la célula es una célula de levadura, preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe o Pichia pastoris.

12. La célula de la reivindicación 11, en donde la célula de mamífero es:

(a) una célula fotorreceptora, una célula bastón de la retina, una célula cono de la retina, una célula ganglionar de la retina, una neurona bipolar, una célula ganglional, una neurona pseudounipolar, una neurona multipolar, una neurona piramidal, una célula de Purkinje o una célula granular; o (b) una célula de melanoma, una célula COS; una célula BHK; una célula HEK293; una célula CHO; una 5 célula de mieloma; o una célula MDCK.

13. El canal iónico inducible por luz de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, o la canalrodopsina de acuerdo con la reivindicación 7, o la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9, o la célula de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso como medicamento.

14. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10, para uso en terapia génica.

15. El canal iónico inducible por luz de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, o la canalrodopsina de acuerdo con la reivindicación 7, o la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9, o la célula de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de la ceguera o vista reducida.

16. El canal iónico inducible por luz de acuerdo con la reivindicación 5, que tiene treonina, serina o alanina en una posición correspondiente a la posición 128 de la SEQ ID NO: 1; y/o alanina en una posición correspondiente a la posición 156 de la SEQ ID NO: 1, para su uso en la ablación de células cancerosas, en donde preferiblemente las células cancerosas son células cancerosas de melanoma.

17. El uso de un canal iónico inducible por luz de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, o una canalrodopsina de acuerdo con la reivindicación 7, o una célula de acuerdo con la reivindicación 10, en un cribado de alto rendimiento.