Bibliotecas de fragmentos de Fab y métodos para su uso.

Método de producción de una biblioteca de Fab, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de vectores en la que cada vector de la pluralidad de vectores comprende:

- una primera región de clonación y una segunda región de clonación, en la que

- cada región de clonación comprende al menos un sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector,

- estando cada región de clonación flanqueada en el extremo 5' por un sitio de unión a ribosomas y una secuencia señal,

- un polinucleótido que codifica una región de anclaje, localizada en el extremo 3' de la segunda región de clonación,

- un polinucleótido que codifica una región constante de cadena pesada o una porción de la misma localizada entre el sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector de la segunda región de clonación y la región de anclaje,

- un polinucleótido que codifica un marcador,

comprendiendo el método:

introducir en la primera región de clonación un miembro de una primera pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una primera pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera de un anticuerpo posiblemente seguida por una región constante de cadena ligera de un anticuerpo,

introducir por separado en la segunda región de clonación de cada vector un miembro de una segunda pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una segunda pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de un anticuerpo,

e

introducir cada uno de los vectores en una célula hospedadora para proporcionar una pluralidad de partículas de la cápside comprendiendo cada una de ellas un miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos variables y un miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos, para constituir de este modo la biblioteca de anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Bibliotecas de fragmentos de Fab y métodos para su uso

La presente invención se refiere en general a métodos para construir bibliotecas de presentación de fagos de fragmentos Fab humanos, tal como se define en las reivindicaciones.

La presentación en un fago filamentoso, en combinación con la selección, forma una herramienta poderosa para la identificación de fármacos basados en péptidos o proteínas (Winter et al., 1994; Clackson et al., 1994). De estos, los anticuerpos son de especial interés, debido a su capacidad para reconocer una variedad de dianas con alta especificidad y afinidad. En particular, el uso de anticuerpos humanos parciales o completos, que no provocan o provocan una respuesta inmunitaria mínima cuando se administran a los pacientes, está produciendo una lista creciente de fármacos basados en proteínas aprobados por la FDA (Holliger et al. 1998). La tecnología de presentación de fagos permite la generación de grandes repertorios de anticuerpos humanos (Marks et al., 1991, Hoogenboom et al., 1992; Griffiths et al., 1993; Vaughan et al., 1996), y los procedimientos de bioselección permiten la selección de anticuerpos individuales con una especificidad deseada.

Las claves del éxito de la tecnología fueron dos observaciones críticas: (i) la expresión de fragmentos funcionales de anticuerpos mediante la secreción en el periplasma de E. coli (Better ef al., 1988; Skerra etal., 1988) y (ii) el acceso rápido a grupos génicos de la región variable por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (Larrick et al., 1989; Ward etal., 1989; Marks etal., 1991). Para la construcción de bibliotecas de anticuerpos, se amplifican genes V a partir del ADNc de las células B y genes de la cadena pesada y ligera se combinan aleatoriamente y se clonan para codificar una biblioteca combinatoria de fragmentos Fv monocatenarios (scFv, single chain Fv) o Fab (Marks et al., 1991; Clackson et al. 1991; Persson et al., 1991; Orumef al., 1993). El repertorio de anticuerpos naturales primarios (no seleccionados) dentro de las células B contiene una gran matriz de anticuerpos que reconocen una variedad de antígenos; esta matriz puede clonarse como un repertorio 'virgen' de genes reorganizados, recogiendo los genes V del ARNm de la IgM de las células B de donantes humanos no inmunizados, aislados de linfocitos de sangre periférica (Marks et al., 1991), médula ósea o amígdalas (Vaughan et al., 1996) o de fuentes animales similares (Gram et al., 1992). Este procedimiento proporciona el acceso a anticuerpos para los que no se ha encontrado aún un antígeno, aunque la frecuencia de estos anticuerpos genuinos de 'línea germinal' tendrá una fuerte dependencia de la fuente de células B (Klein ef al., 1997). Una sola biblioteca 'virgen', si es suficientemente grande y diversa, puede, en efecto, usarse para generar anticuerpos contra un gran panel de antígenos, incluyendo autoantígenos y antígenos no inmunogénicos y relativamente tóxicos (Griffiths et al., 1993; Marks et al., 1991). En un enfoque distinto, los anticuerpos pueden construirse artificialmente, mediante un ensamblaje in vitro de los segmentos génicos V y los segmentos D/J, produciendo anticuerpos 'sintéticos' (Hoogenboom et al., 1992). Una desventaja principal de estos procedimientos es que a partir de las bibliotecas iniciales 'vírgenes' y 'sintéticas', únicamente se aislaron anticuerpos de afinidad moderada (Marks et al., 1991; Nissim etal., 1994). A lo largo de los últimos años se han desarrollado técnicas más eficientes para construir bibliotecas más grandes de fragmentos de anticuerpos, usando métodos de recombinación in vivo sofisticados (Griffiths et al., 1993) o procedimientos de clonación de fuerza bruta (Vaughan et al., 1996; Sheets etal., 1998). Dichas grandes bibliotecas han producido un mayor número de anticuerpos humanos por antígenos ensayados, con una afinidad promedio mucho más alta (por encima de sub-nanomolar). Sin embargo, las restricciones técnicas en el tamaño de las bibliotecas que pueden obtenerse o manejarse en la selección, la pérdida de diversidad de las bibliotecas tras la amplificación de la biblioteca y el análisis relativamente largo de la ruta aguas abajo de los anticuerpos seleccionados, es decir, análisis de afinidad a gran escala, ha limitado la difusión de estas bibliotecas como herramientas genéricas para la generación de anticuerpos.

La mayor parte de las bibliotecas producidas hasta la fecha usan el formato monocatenario para la presentación de fagos (Vaughan et al., 1996; Sheets et al. 1998). Un informe describió el uso de una biblioteca de Fab humanos vírgenes en fagos (sin permitir la exploración inmediata de los fragmentos Fab solubles seleccionados) (Griffiths et al., 1994). Los scFv tienen tendencia a formar dímeros y multímeros de orden más alto de un modo dependiente del clon y relativamente impredecible (Weidner, et al. 1992; Holliger, et al. 1993; Marks et al., 1993). En consecuencia, el ensayo de afinidad usado, (tal como análisis por BIAcore) a menudo necesita la purificación de los fragmentos de anticuerpos seleccionados. Por ejemplo, la clasificación de las velocidades de disociación, usando BIAcore no es fácilmente posible con fragmentos scFv no purificados; la fracción monomérica de los clones scFv seleccionados necesitan purificarse primero mediante cromatografía de afinidad y filtración en gel (Sheets etal., 1998; Schier etal., 1996).

Tal como postularon y observaron Griffiths y colaboradores (Griffiths et al., 1994), el tamaño de la biblioteca de anticuerpos determina la posibilidad de la selección de anticuerpos de alta afinidad con respecto al antígeno. La comparación del primer repertorio de scFv vírgenes que contenía 2,9 x 107 clones (Marks et al., 1991), con un repertorio de scFv recientemente construido de aproximadamente 1010 clones (Vaughan et al., 1996; Sheets et al. 1998), confirma este postulado: el aumento del tamaño de la biblioteca en 500 veces dio como resultado afinidades aproximadamente 100 veces más altas. Este aumento se produce disminuyendo las velocidades de disociación de 10'1-10'2s'1, para los fragmentos seleccionados de la biblioteca de menor tamaño, a 10'3-10'4s'1 para los seleccionados de la biblioteca de mayor tamaño.

Huse eí al. Science 246:1275-1281 (1989) divulgan la generación de una biblioteca combinatoria grande del repertorio de inmunoglobulinas en fago Lambda.

Es un objeto de la invención crear una biblioteca de Fab que sea una fuente valiosa de anticuerpos para muchas dianas distintas y que desempeñará un papel vital en el descubrimiento de dianas y la validación en el área de la genómica funcional.

La invención proporciona un método para fabricar una biblioteca de Fab, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de vectores en la que cada vector de la pluralidad de vectores comprende:

- una primera región de clonación y una segunda región de clonación, en las que

- cada región de clonación comprende al menos un sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector,

- estando cada región de clonación flanqueada en el extremo 5' por un sitio de unión a ribosomas y una secuencia señal,

- un polinucleótido que codifica una región de anclaje, localizada en el extremo 3' de la segunda región de clonación,

- un polinucleótido que codifica una región constante de la cadena pesada o una porción de la misma localizada entre el sitio de restricción de enzimas único para el vector de la segunda región de clonación y la región de anclaje,

- un polinucleótido que codifica un marcador, comprendiendo el método:

introducir en la primera región de clonación un miembro de una primera pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una primera pluralidad de polipéptidos, en los que el miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de la cadena ligera del anticuerpo posiblemente seguida por una región constante de la cadena ligera del anticuerpo, introduciendo por separado en la segunda región de clonación de cada vector un miembro de una segunda pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una segunda pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, e

introducir cada uno de los vectores en una célula hospedadora para proporcionar una pluralidad de partículas de la cápside comprendiendo cada una un miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos variables y un miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos, para... [Seguir leyendo]

1. Método de producción de una biblioteca de Fab, comprendiendo la biblioteca una pluralidad de vectores en la que cada vector de la pluralidad de vectores comprende:

- una primera región de clonación y una segunda región de clonación, en la que

- cada región de clonación comprende al menos un sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector,

- estando cada región de clonación flanqueada en el extremo 5' por un sitio de unión a ribosomas y una secuencia señal,

- un polinucleótido que codifica una región de anclaje, localizada en el extremo 3' de la segunda región de clonación,

- un polinucleótido que codifica una región constante de cadena pesada o una porción de la misma localizada entre el sitio de escisión de enzimas de restricción único para el vector de la segunda región de clonación y la región de anclaje,

- un polinucleótido que codifica un marcador, comprendiendo el método:

introducir en la primera región de clonación un miembro de una primera pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una primera pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera de un anticuerpo posiblemente seguida por una región constante de cadena ligera de un anticuerpo,

introducir por separado en la segunda región de clonación de cada vector un miembro de una segunda pluralidad de polinucleótidos variables, codificando dicha pluralidad de polinucleótidos variables una segunda pluralidad de polipéptidos, en la que el miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de un anticuerpo,

e

introducir cada uno de los vectores en una célula hospedadora para proporcionar una pluralidad de partículas de la cápside comprendiendo cada una de ellas un miembro de la primera pluralidad de polinucleótidos variables y un miembro de la segunda pluralidad de polinucleótidos, para constituir de este modo la biblioteca de anticuerpos o fragmentos de los mismos.

2. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la pluralidad de polinucleótidos codifica una biblioteca de Fab de al menos 109 Fab distintos.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pluralidad de polinucleótidos codifica una biblioteca de Fab de al menos 101° Fab distintos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pluralidad de polinucleótidos codifica una biblioteca de Fab de al menos 3,7 x 101° Fab distintos.

5. Método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que además comprende las etapas de:

amplificar una primera pluralidad de polinucleótidos con un primer conjunto de cebadores, y

amplificar una segunda pluralidad de polinucleótidos con un segundo conjunto de cebadores,

en el que cada conjunto de cebadores comprende oligonucleótidos diseñados para que sean homólogos al

extremo 5' y 3' de los polinucleótidos que codifican las regiones variables del anticuerpo o partes del mismo, de

modo que estos puedan usarse para amplificar los grupos de polinucleótidos variables a partir de fuentes naturales

o sintéticas de genes conservando al mismo tiempo todo o parte del sitio de combinación antigénica del

anticuerpo.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la región de anclaje comprende una proteína de recubrimiento.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la proteína de recubrimiento es un producto del gen III.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la proteína de recubrimiento comprende la proteína de recubrimiento menor III de un fago filamentoso fd.