Polipéptidos de dominio Kunitz modificado y su uso para reducir la isquemia o el inicio de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico.

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (sec.

con núm. de ident.:1), en donde

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o está ausente; Xaa10 es Asp;

Xaa11 es Asp;

Xaa13 es Pro;

Xaa15 es Arg;

Xaa16 es Ala;

Xaa17 es Ala;

Xaa18 es His;

Xaa19 es Pro;

Xaa21 es Trp;

Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe;

Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe;

Xaa31 es Glu;

Xaa32 es Glu;

Xaa34 es Ile;

Xaa35 es Tyr;

Xaa39 es Glu;

Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly y Ala;

Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gly;

Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Phe y Tyr; y

en donde el polipéptido inhibe la calicreína.

Polipéptidos de dominio kunitz modificado y su uso para reducir la isquemia o el inicio de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico Antecedentes de la invención Las proteasas están implicadas en una amplia gama de rutas biológicas. En particular, las proteasas de serina tales como la calicreína, plasmina, elastasa, activador de plasminógeno uroquinasa, trombina, inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteína humana, y factores de coagulación tales como los factores VIIa, IXa, Xa, XIa, y XIIa se han implicado en las vías que afectan el flujo sanguíneo, por ejemplo, la isquemia general y focal, invasión tumoral, fibrinólisis, pérdida de sangre perioperatoria, e inflamación. Inhibidores de proteasas de serina específicos, por lo tanto, han recibido atención como posibles objetivos para fármaco de varias enfermedades isquémicas.

Un inhibidor de este tipo, aprotinina (denominado además inhibidor de tripsina pancreática bovina o BPTI) , obtenido a partir de pulmón bovino, se aprobó en los Estados Unidos para el uso profiláctico en la reducción de la pérdida de sangre perioperatoria y la necesidad de transfusión en pacientes sometidos a la derivación cardiopulmonar (CPB) , por ejemplo, en el curso de un procedimiento de injerto de derivación de la arteria coronaria. La aprotinina se comercializa bajo el nombre comercial TRASYLOL® (Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut) y previamente se aprobó para su uso en el tratamiento de la pancreatitis. La efectividad de la aprotinina está asociada con sus capacidades relativamente inespecíficas de inhibir una variedad de proteasas de serina, incluyendo calicreína plasmática y plasmina. Estas proteasas son importantes en una serie de rutas del sistema de activación de contacto (CAS) .

CAS es inicialmente activado cuando la sangre completa se pone en contacto con la superficie de sustratos foráneos (por ejemplo, caolín, vidrio, sulfato de dextrano, o superficies óseas dañadas) . Calicreína, una proteasa de serina, es una enzima plasmática que inicia la cascada de CAS conduciendo a la activación de neutrófilos, plasmina, coagulación, y varias cininas. Calicreína se secreta como un zimógeno (pre-calicreína) que circula como una molécula inactiva hasta activarse por un evento proteolítico temprano en la cascada de activación de contacto. Ciertamente, la inhibición específica de la calicreína puede ser un enfoque muy atractivo para el control de la pérdida de sangre asociado con la CPB y el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica (SIR) como puede encontrarse durante, por ejemplo, varios procedimientos quirúrgicos invasivos.

A pesar de ser el único compuesto con licencia para prevenir la pérdida de sangre perioperatoria en la CPB para los procedimientos de injerto de la derivación de la arteria coronaria (CABG) , la aprotinina es no tan ampliamente usada como podría esperarse. Existen serias preocupaciones acerca del uso de este polipéptido bovino en pacientes que requieren la CPB, y en particular el uso de este compuesto en los procedimientos de CABG. La aprotinina no es específica para la calicreína, pero interactúa con enzimas adicionales (por ejemplo, plasmina) en múltiples rutas. Así, el mecanismo de acción de la aprotinina es ampliamente especulativo, y la falta de comprensión precisa de qué se afecta durante el tratamiento con la aprotinina produce el riesgo de complicaciones durante el tratamiento. Una complicación frecuentemente citada es la trombosis incontrolada, debido a las acciones de aprotinina en la vía fibrinolítica. Existe preocupación no sólo sobre tales eventos hiperagudos como la trombosis del vaso mayor en el período perioperatorio, sino también sobre la permeabilidad del injerto después del procedimiento de CABG. Además, como una proteína de origen natural obtenida de pulmón bovino, la administración de la aprotinina en seres humanos puede inducir reacciones de hipersensibilidad severa o anafilácticas o anafilactoides después de la primera y más frecuentemente, después de la administración repetida a los pacientes. Esta es particularmente la preocupación en el gran número de pacientes que tienen procedimientos de CABG repetidos. Adicionalmente, existe una creciente preocupación pública acerca del uso del material derivado de fuentes bovinas como un vector potencial para la transmisión de la encefalopatía espongiforme bovina a los seres humanos.

Las preocupaciones dejan claro que continúan siendo una necesidad los medios y métodos más eficaces y más específicos para prevenir o reducir pérdida de sangre perioperatoria y el inicio de la SIR en un paciente sometido a cirugía, lo que resulta en la activación de CAS, tales como los procedimientos de CABG en pacientes de la CPB, o reemplazo de cadera.

Breve descripción de la invención La presente invención se define por las reivindicaciones.

Esta presente descripción que incluye la invención se basa en el descubrimiento de péptidos que inhiben las proteasas de serina. Proteasas de serina tal como, por ejemplo, la calicreína, están implicadas en, por ejemplo, las vías que conducen a la pérdida excesiva de sangre perioperatoria y el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica. Inhibidores de péptido

calicreína preferidos incluyen los descritos en la patente de Estados Unidos núms. 6, 333, 402 y 6, 057, 287 en Markland y otros Está dirigida en parte al uso de los péptidos en métodos terapéuticos y composiciones adecuadas para usar en la eliminación o reducción de varias isquemias, que incluyen pero sin limitarse a la pérdida de sangre perioperatoria, y el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica. La pérdida de sangre perioperatoria resulta de los procedimientos invasivos quirúrgicos que conducen a la activación por contacto de los componentes del complemento y los sistemas de coagulación/fibrinólisis. Más específicamente, la invención proporciona métodos para usar inhibidores de la calicreína para reducir o prevenir la pérdida de sangre perioperatoria y una respuesta inflamatoria sistémica en pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos invasivos, especialmente cirugía cardiotorácica.

En un ejemplo, la presente descripción que comprende la invención se dirige a un método para prevenir o reducir la isquemia en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (sec. con núm. de ident.:1) , en donde Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o está ausente; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asp y Glu; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr; Xaa18 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn e Ile; Xaa21 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Trp, Phe, Tyr, His e Ile; Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa31 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr; Xaa32 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Phe y Tyr; y en donde el polipéptido inhibe la calicreína.

En un caso particular, la isquemia es pérdida de sangre perioperatoria... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (sec. con núm. de ident.:1) , en donde Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o está ausente; Xaa10 es Asp; Xaa11 es Asp; Xaa13 es Pro; Xaa15 es Arg; Xaa16 es Ala; Xaa17 es Ala; Xaa18 es His; Xaa19 es Pro; Xaa21 es Trp; Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa31 es Glu; Xaa32 es Glu; Xaa34 es Ile; Xaa35 es Tyr; Xaa39 es Glu; Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Phe y Tyr; y en donde el polipéptido inhibe la calicreína.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos: Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 5-60 de la sec. con núm. de ident.:2) .

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de aminoácido tiene al menos 95% de identidad a la sec. con núm. de ident.: 2.

4. Un polipéptido que comprende una porción de la secuencia de aminoácidos que se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha porción se une a calicreína.

5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para usar en la prevención o reducción de la isquemia en un paciente, o para usar en la prevención o reducción del inicio de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente.

6. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el procedimiento quirúrgico es cirugía cardiotorácica.

9. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el procedimiento quirúrgico es injerto de derivación de la arteria coronaria.

10. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el procedimiento quirúrgico es derivación cardiopulmonar.

11. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el procedimiento quirúrgico es un reemplazo de cadera o una fractura del esternón.