Anticuerpos humanizados específicos de la forma protofibrilar del péptido beta-amiloide.

Anticuerpo humanizado específico de la forma protofibrilar del péptido A-β

, caracterizado por que:

- dicho anticuerpo comprende los CDR de secuencia SEC ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 y 20, los CDR de secuencia SEC ID NO: 10, 12, 14, 32, 18 y 20 o los CDR de secuencia SEC ID NO: 10, 12, 30, 32, 18 y 20;

- su afinidad para la forma protofibrilar del péptido Aβ es al menos 100 veces superior a su afinidad para las otras formas de este péptido, siendo la afinidad la EC50 medida por ELISA; y

- dicho anticuerpo se une a los péptidos A-β agregados en placas seniles y no a los depósitos difusos de péptidos A- β.

Anticuerpos humanizados específicos de la forma protofibrilar del péptldo beta-amllolde

La presente Invención tiene por objeto unos anticuerpos humanizados específicos de la forma protofibrilar del péptido p-amiloide. La presente invención tiene también por objeto la utilización terapéutica, diagnóstica y/o preventiva de estos anticuerpos, en particular asociada a la activación y a la progresión de trastornos neurodegenerativos y/o a las enfermedades relacionadas con el depósito de placas amlloldes, y en particular de la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que afecta una amplia proporción de la población de edad avanzada. Esta enfermedad está caracterizada en el plano clínico por una pérdida de la memoria y un deterioro de las funciones cognitivas, en el plano neuropatológlco por la presencia en el cerebro de depósitos neurofibrilares intracelulares y de depósitos extracelulares del péptldo p-amüoide (A-P) que forman las placas amiloides. (Yanker ef a/. Nature Med. Vol. 2 N° 8 (1996)). A estas señales se añaden un número importante de otros cambios anormales que incluyen una alteración de los sistemas inmunitarios e inflamatorios, así como una alteración de la función mitocondrial que puede conducir a un aumento del estrés oxidativo, una activación de los mecanismos de la apoptosis y finalmente una muerte celular.

Las placas amiloides están mayoritariamente compuestas de los péptldos A-p a 40 o 42 restos que son generados durante el proceso proteolítico de la proteína precursora del péptido p-amiloide (APP). Los depósitos extracelulares de péptidos A-p representan la característica precoz e invariable de todas las formas de AD, incluyendo las formas familiares (FAD). Las FAD aparecen de manera relativamente precoz (entre los 40 y 60 años) y se deben a mutaciones en el gen de APP en el 5% de los casos de FAD (> 20 familias) con seis mutaciones con errores de Interpretación, simples o dobles; en el gen de la presenilina 1 (PS 1) en el 50 al 70% de los casos de FAD (> a 200 familias) con más de 80 mutaciones diferentes identificadas hasta ahora; y en el gen de la presenilina 2 (PS 2) en menos casos de FAD, con 2 mutaciones con error de interpretación descritas en 8 familias. Unas mutaciones en estos tres genes se demostraron como inductoras de cambios en la proteólisis de APP, que conducen a una sobreproducción de A-p y a la aparición precoz de la patología y de los síntomas, que son similares a los de las formas esporádicas de AD.

La toxicidad neuronal de las placas amiloides podría residir en las fibrillas de peso molecular importante que se forman por agregación de péptidos A-p solubles en formas fibrilares en primer lugar solubles (denominada también forma protofibrilar) que son después convertidas en formas insolubles incorporadas en las placas amiloides. En efecto, se ha demostrado /n v/fro que el péptido A-p soluble se agregaba progresivamente en una forma fibrilar (es decir, que puede ser marcado por agentes tales como el rojo congo o la tioflavina S, que reconocen las estructuras terciarlas en hojas beta de los péptidos/proteínas), de alto peso molecular (>200 kDa) pero todavía soluble. Como esta forma es soluble, es frecuentemente denominada forma protofibrilar, mientras que las fibrillas resultan de una agregación aún más importante que conduce a la pérdida de solubilidad. Las formas protofibrilares de transición son generalmente consideradas como los precursoras de las fibras amiloides y podrían ser responsables de la disfunción celular y de la pérdida neuronal en la enfermedad de Alzheimer y en otras enfermedades relacionadas con la agregación de proteínas.

Se ha demostrado que las placas amiloides seniles (es decir agregadas, que también se denominan placas maduras) están correlacionadas con el estatuto cognitivo de los pacientes de Alzheimer, contrariamente a los depósitos difusos de péptldo A-p que también están ampliamente presentes en los pacientes no afectados. (Duyckaerts ef a/., Neuroblol.Aglng 1997;18: 33-42 y Jellinger ef a/. 1998; 54:77-95). Determinar en particular estas placas amlloldes seniles permite por lo tanto tratar la patología de Alzheimer de manera más específica y eficaz.

Se probaron numerosos tratamientos a fin de prevenir la formación de los péptidos A-p, como por ejemplo unos Inhibidores del proceso proteolítico de APP.

Se probaron unas estrategias de ¡nmunoterapia como la administración de anticuerpos anti-A-p (para disminuir los depósitos amlloldes) o la Inmunización con unos antígenos de los péptldos A-p (para promover una respuesta humoral) a fin de reducir el tamaño y la densidad de las placas.

Por ejemplo, se ha descrito (documento US 7 179 463) un método de tratamiento contra la enfermedad de Alzheimer que consiste en administrar un anticuerpo dirigido contra un protofibrilla que presenta una mutación Artic en el interior de la reglón que codifica para el péptido A-p.

No se ha descrito realmente ningún ejemplo de anticuerpo. Además, no se ha realizado ninguna comparación de la afinidad de los anticuerpos para los péptidos en función del peso molecular de estos péptldos. Otras patentes (documentos US 6 761 888 y US 6 750 324) han evocado unos anticuerpos que reconocen diversos epítopos a lo largo de la secuencia en aminoácidos del péptldo A-P42. Se depositó una solicitud internacional (documento WO 2007/108756) que se refiere a unos anticuerpos específicos de las protoflbrlllas pero los anticuerpos descritos

reconocen al mismo tiempo los péptidos A-p de alto peso molecular y los ollgómeros de peso medio. Además, no se menciona la afinidad de los anticuerpos para las placas maduras con respecto a su afinidad para las placas difusas.

Schupf ef a/., vol. 105, n° 37, P. 14052-14057 (2008) describe la generación de un anticuerpo murlno (13C3) por Inmunización con Abeta42 flbrllar. 13C3 es específica para la forma protoflbrllarla del péptldo Abeta y no reacciona con las fracciones de bajo peso molecular.

A pesar de la evolución actual de los conocimientos a propósito de la enfermedad de Alzhelmer, existe todavía una necesidad para unas composiciones y unos métodos de tratamiento y/o de prevención de esta patología que limita al máximo los efectos secundarlos. Unos anticuerpos tales como los descritos en la presente solicitud, humanizados y específicos de la forma protoflbrllar de los péptidos A-p tienen como objetivo resolver este problema. Permitiendo el reconocimiento de las placas amlloldes seniles y no de las placas difusas, los anticuerpos objeto de la Invención reconocen las placas patológicas de manera mucho más eficaz que unos anticuerpos que reconocen todas las formas de Abeta, que serán en gran parte fijados en los depósitos difusos o fijados sobre las formas solubles de péptldo A-p monomérlco o de bajo peso molecular.

Además, el hecho de reconocer únicamente las formas protoflbrilares de los péptidos A-p y no las formas protoflbrllares de otras proteínas no relacionadas con la enfermedad de Alzhelmer, evita unas uniones Inútiles susceptibles de disminuir la concentración de anticuerpos eficaces sobre la enfermedad.

El anticuerpo murlno que se ha humanizado llevará el nombre de anticuerpo 13C3 en toda la presente solicitud.

Las secuencias que pueden codificar para o constituir los anticuerpos humanizados descritos en la presente solicitud figuran en la tabla 2.

La presente Invención se define mediante las reivindicaciones.

La presente solicitud describe un anticuerpo humanizado que se une específicamente a la forma protofibrilar del péptldo A-p, es decir un péptldo de alto peso molecular.

En un modo más ventajoso, el anticuerpo se une al péptldo A-p que tiene un peso molecular superior a 200, 300, 400 o 500 kDa.

Se describe asimismo que el anticuerpo se une a los péptidos A-p agregados en placas seniles y no a los depósitos difusos de péptidos A-p.

En un modo de realización ventajoso, el anticuerpo se une específicamente a las formas protofibrilares del péptido A-p, pero no a las demás proteínas de estructura amllolde (como por ejemplo las IAPP Islet Amyloid Polypeptide).

La presente solicitud describe también un anticuerpo humanizado que tiene unas funciones efectoras disminuidas, lo que permite una limitación de los efectos adversos, tales como la aparición de microhemorragias y edemas vasogénlcos.

En un modo de realización ventajoso, el anticuerpo no posee más que funciones efectoras.

En un modo de realización aún más ventajoso, el anticuerpo es una ¡nmunoglobullna G 4 cuyo dominio Fe ha sufrido unas mutaciones que disminuyen la producción de seml-moléculas.

1. Anticuerpo humanizado específico de la forma protofibrilardel péptido A-p, caracterizado porque:

- dicho anticuerpo comprende los CDR de secuencia SEC ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 y 20, los CDR de secuencia SEC ID NO: 10, 12, 14, 32, 18y 20 o los CDR de secuencia SEC ID NO: 10, 12, 30, 32, 18 y 20;

- su afinidad para la forma protoflbrilar del péptido Ap es al menos 100 veces superior a su afinidad para las otras formas de este péptido, siendo la afinidad la EC50 medida por ELISA; y

- dicho anticuerpo se une a los péptldos A-p agregados en placas seniles y no a los depósitos difusos de péptidos A-

P.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende los CDR codificados por las secuencias nucleotídlcas SEC ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 y 19, o por unas secuencias que difieren respectivamente por 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótldos de estas secuencias.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende los CDR codificados por las secuencias nucleotídlcas SEC ID NO: 9, 11, 13, 31, 17 y 19, o por unas secuencias que difieren respectivamente por 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótldos de estas secuencias.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende los CDR codificados por las secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 9, 11, 29, 31, 17 y 19, o por unas secuencias que difieren respectivamente por 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de estas secuencias.

5. Anticuerpo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la parte variable de su cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos el 90% de Identidad con una de las secuencias SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 28.

6. Anticuerpo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la parte variable de su cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos el 99% de Identidad con una de las secuencias SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 24.

7. Anticuerpo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende una cadena pesada que comprende una parte variable de secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 28.

8. Anticuerpo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende una cadena ligera que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 24.

9. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1-2 y 5-8, caracterizado por que comprende partes variables de secuencias pollpeptídicas SEC ID NO: 6 y 8.

10. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1, 3 y 5-8, caracterizado por que comprende partes variables de secuencias pollpeptídicas SEC ID NO: 6 y 24.

11. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 y 4-8, caracterizado por que comprende partes variables de secuencias pollpeptídicas SEC ID NO: 28 y 24.

12. Anticuerpo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una cadena pesada que presenta al menos el 80% de identidad con una de las secuencias polipeptídicas SEC ID NO: 2 y SEC ID NO:

26.

13. Anticuerpo según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende una cadena ligera que presenta al menos el 80% de identidad con una de las secuencias polipeptídicas SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 22.

14. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1-2, 5-9, 12 y 13, caracterizado porque comprende unas cadenas de secuencias polipeptídicas SEC ID NO: 2 y 4.

15. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1, 3, 5-8, 10, 12 y 13, caracterizado por que comprende unas cadenas de secuencias pollpeptídicas SEC ID NO: 2 y 22.

16. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1, 4-8 y 11-13, caracterizado porque comprende unas cadenas de secuencias polipeptídicas SEC ID NO: 26 y 22.

17. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que Induce una disminución de las placas amiloides.

18. Anticuerpo humanizado específico de la forma protoflbrllar del péptldo A-p, caracterizado por que comprende:

- una cadena pesada que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 6 y una cadena ligera que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 8,

- una cadena pesada que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 6 y una cadena ligera que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 24, o

- una cadena pesada que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 28 y una cadena ligera que comprende una parte variable de secuencia pollpeptídica SEO ID NO: 24.

19. Anticuerpo según la reivindicación 18, caracterizado porque comprende:

- una cadena pesada que comprende la secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 2 y una cadena ligera que comprende la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 4,

- una cadena pesada que comprende la secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 2 y una cadena ligera que comprende la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 22, o

- una cadena pesada que comprende la secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 26 y una cadena ligera que comprende la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 22.

20. Anticuerpo según la reivindicación 19, caracterizado porque comprende:

- una cadena pesada que consiste en la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 2, y una cadena ligera que consiste en la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 4,

- una cadena pesada que consiste en la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 2 y una cadena ligera que consiste en la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 22, o

- una cadena pesada que consiste en la secuencia polipeptídlca SEC ID NO: 26, o una cadena ligera que consiste en la secuencia pollpeptídica SEC ID NO: 22.

21. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su utilización en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

22. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y unos

excipientes.

23. Célula que produce un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

24. Procedimiento de producción de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado por que comprende el cultivo de células según la reivindicación 23.

25. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para su utilización como medicamento.

26. Pollnucleótldo para la expresión del anticuerpo según la reivindicación 1 que codifica para un polipéptido que presenta al menos el 99% de Identidad con una de las secuencias SEC ID N°^: 2, 4, 6, 8, 22, 24, 26 o 28.

27. Pollnucleótldo para la expresión del anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que presenta una secuencia que presenta al menos el 99% de Identidad con una de las secuencias SEC ID N°^: 1, 3, 5, 7, 21, 23, 25, o 27.

28. Vector recomblnante que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 26 y 27.

29. Célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 28.