Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activación linfocitaria (LAG-3) y usos de los mismos.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo,

que se une al gen 3 de activación de linfocitos humanos (LAG-3), en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº: 43.

Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activación linfocitaria (LAG-3) y usos de los mismos Antecedentes de la invención

El gen 3 de activación linfocitaria o LAG-3 (también conocido como CD223), es un miembro de la familia supergénica de las inmunoglobulinas y está estructural y genéticamente relacionado con CD4. El LAG-3 no se expresa en linfocitos de la sangre periférica en reposo, pero se expresa en linfocitos T y en linfocitos citolíticos espontáneos. La LAG-3 es una proteína de membrana codificada por un gen localizado en la parte distal del brazo corto del cromosoma 12, cerca del gen CD4, lo que sugiere que el gen LAG-3 puede haber evolucionado mediante duplicación genética (Triebel etal. (199) J. Exp. Med. 171:1393-145).

Al igual que el CD4, se ha demostrado que la LAG-3 interacciona con moléculas del MHC de clase II pero, a diferencia del CD4, la LAG-3 no interacciona con la proteína gp12 del virus de la inmunodeficiencia humana (Baixeras etal. (1992) J. Exp. Med. 176:327-337). Los estudios con una proteína de fusión LAG-3 inmunoglobulínica (sLAG-3lg) demostraron una unión directa y específica de la LAG-3 al MHC de clase II sobre la superficie celular (Huard etal. (1996) Eur. J. Immunol. 26:118-1186).

En los estudios in vitro de las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno, la adición de anticuerpos anti- LAG-3 produjo un aumento en la proliferación de linfocitos T, una mayor expresión de antígenos de activación, tales como CD25, y mayores concentraciones de citocinas, tales como interferón gamma e interleucina 4, lo que respalda la teoría de que la interacción entre LAG-/MHC de clase II desempeña una función en la estimulación reductora dependiente del antígeno de linfocitos T CD4+ (Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:3216-3221). Se ha demostrado que la región intracitoplásmica de la LAG-3 interacciona con una proteína llamada LAP, que se cree es una molécula de transducción de señales involucrada en la reducción de la vía de activación de CD3/TCR (louzalen et al. (21) Eur. J. Immunol. 31:2885-2891). Además, se ha detectado que los linfocitos T CD4+CD25+ reguladores (Treg) expresan la LAG-3 al activarse y los anticuerpos contra la LAG-3 inhiben la supresión por parte de los linfocitos Treg tanto en in vitro como en in vivo, lo cual sugiere que la LAG-3 contribuye a la actividad supresora de los linfocitos Treg (Huang, C. et al. (24) Immunity 21:53-513). Es más, se ha detectado que la LAG-3 regula de forma negativa la homeostasis de linfocitos T por parte de los linfocitos T reguladores tanto en mecanismos dependientes como independientes del linfocito T (Workman, C.J. and Vignali, D.A. (25) J. Immunol. 174:688-695).

En ciertas circunstancias, se ha detectado que la LAG-3 también posee efectos inmunoestimuladores. Por ejemplo, las células tumorales transfectadas con LAG-3 trasplantadas en ratones singénicos mostraron una reducción acusada del crecimiento o regresión total en comparación con células tumorales que no habían sido transfectadas, lo que sugiere que la expresión de la LAG-3 en las células tumorales estimuló una respuesta antitumoral mediante la estimulación de las células presentadoras de antígenos a través de moléculas del MHC de clase II (Prigent et al. (1999) Eur J. Immunol. 29:3867-3876). Además, se ha detectado que la proteína de fusión LAG-3 Ig soluble estimula tanto respuestas inmunitahas humorales como celulares cuando se administran a ratones junto con un antígeno, lo que indica que la LAG-3 Ig soluble puede desempeñar las funciones de un adyuvante de una vacuna (El Mir and Triebel (2) J. Immunol. 164:5583-5589). Además, se ha detectado que la LAG-3 Ig soluble humana amplifica la generación in vitro de inmunidad específica para un tumor de tipo I (Casati et al. (26) Cáncer Res. 66:445-446). La actividad funcional de la LAG-3 se examina con más detalle en Triebel (23) Trends Immunol. 24:619-622. En vista de lo anterior, agentes adicionales para modular la actividad de la LAG-3 resultan interesantes.

Resumen

La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales aislados (en particular anticuerpos monoclonales humanos) y porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la LAG-3 humana y comprenden: (a) una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID N2: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID N2: 43.

Los anticuerpos, y porciones de unión a antígeno de los mismos, de la invención presentan propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen una gran afinidad de unión a la LAG-3 humana, unión a la LAG-3 humana y de mono (p. ej., LAG-3 de mono Cynomolgus y/o Rhesus) pero no a la LAG-3 de ratón, la capacidad de inhibir la unión de la LAG-3 a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II y/o la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno. Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, para detectar la proteína LAG-3 o para estimular las respuestas de linfocitos T específicas para un antígeno, como por ejemplo, en un sujeto que padece un tumor o un sujeto portador de un virus.

En un aspecto, el anticuerpo de la invención, o la porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno de éste, donde el anticuerpo se une a la LAG-3 humana y presenta al menos una de las siguientes propiedades:

(a) se une a LAG-3 de mono;

(b) no se une a LAG-3 de ratón;

(c) inhibe la unión de la LAG-3 a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II; y

(d) estimula una respuesta inmunitaria.

Preferentemente, el anticuerpo presenta al menos dos de las propiedades (a), (b), (c) y (d). Más preferentemente, el anticuerpo presenta al menos tres de las propiedades (a), (b), (c) y (d). Incluso más preferentemente, el anticuerpo presenta las cuatro propiedades (a), (b), (c) y (d).

En una realización preferida, el anticuerpo estimula una respuesta de linfocitos T específica para un antígeno, tal como la producción de interleucina 2 (IL-2) en una respuesta de linfocitos T específica de un antígeno. En otras realizaciones, el anticuerpo estimula una respuesta inmune tal como una respuesta antitumoral (p. ej., inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de injerto tumoral in vivo) o una respuesta autoinmunitaria (p. ej., estimula el desarrollo de la diabetes en ratones NOD). En otra realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo de la LAG-3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos PGHPLAPG (SEC ID N2: 76). En otra realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo de la LAG-3 humana que comprende la secuencia de aminoácidos HPAPPSSW (SEC ID N2: 77) o PAAPSSWG (SEC ID N2: 78). En otras realizaciones, el anticuerpo se une a la LAG- 3 humana con una Kd de 1 x 1'7 M o menor, se une a la LAG-3 humana con una Kd de 1 x 1'8 M o menor, se une a la LAG-3 humana con una Kd of 5 x 1'9 M o menor, o se une a la LAG-3 humana con una Kd de 1 x 1'9 M o menor. En una realización, el anticuerpo tiñe tejido pituitario por inmunohistoquímica, mientras que en otra realización, el anticuerpo no tiñe tejido pituitario por inmunohistoquímica.

En otro aspecto, el anticuerpo de la invención, o porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno de este, donde el anticuerpo presenta competencia cruzada por la unión a la LAG-3 humana con un anticuerpo de referencia, donde el anticuerpo de referencia comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N2: 37 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N2: 43

En otro aspecto, el anticuerpo de la invención o porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal aislado, o a una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen Vh 3-2 humano, un gen Vh 4-34 humano, un gen Vh 3-33 humano o un gen Vh 1-24 humano, donde el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana. En otro aspecto, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención es un anticuerpo monoclonal aislado, o a una porción de unión a antígeno de este, que comprende una región variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk L18 humano, un gen Vk L6 humano o un gen Vk A27 humano, donde el anticuerpo se une específicamente a la LAG-3 humana. En una realización... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une al gen 3 de activación de linfocitos humanos (LAG-3), en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID N2: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID N2: 43.

2. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID N2: 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEC ID N2: 43.

3. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que comprende secuencias de región variable de cadenas ligera y pesada tal como se exponen en SEC ID N2: 37 y SEC ID N2: 43, respectivamente.

4. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que inhibe la unión de LAG-3 a moléculas de la clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

5. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que estimula una respuesta de linfocito T específica para un antígeno.

6. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo estimula la producción de interleucina-2 por parte del linfocito T específico para un antígeno.

7. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une a la proteína LAG-3 humana con una Kd de 1 x 1'9 o menos.

8. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une a la proteína LAG-3 humana con una Kd de 5 x 1"1° o menos.

9. Una composición que comprende el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

1. La composición de la reivindicación 9, que además comprende al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional.

11. La composición de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4.

12. La composición de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1.

13. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, unido a un agente terapéutico.

14. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

15. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 14.

16. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15.

17. Un método para preparar un anticuerpo anti-LAG-3 que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la reivindicación 16 y aislar el anticuerpo de la célula huésped.

18. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en terapia.

19. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, para su uso en terapia.

2. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, de la reivindicación 19 para el uso de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4.

21. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional, de la reivindicación 19, para el uso de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo anti-PD-1.

22. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y al menos un anticuerpo inmunoestimulador adiciona,

de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en donde el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, y el al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional se administran de manera concurrente, por separado o secuencialmente.

23. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la

composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la estimulación de una respuesta de linfocito T específica para un antígeno.

24. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la 15 composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la estimulación de una respuesta

inmunitaria en un sujeto.

25. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la inhibición del crecimiento de células

tumorales en un sujeto.

26. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en el tratamiento de una infección viral en un sujeto.