Anticuerpos biespecíficos de unión a digoxigenina.

Un anticuerpo biespecífico específico contra digoxigenina (DIG) y una proteína diana para su uso en terapia o diagnósticos,

en el que un ácido nucleico que se ha conjugado con DIG se administra a una célula diana o tejido, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a DIG que comprende un dominio variable de la cadena pesada seleccionado de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P o SEC ID Nº: 2, y un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEC ID Nº:5 o SEC ID Nº: 1;

y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana.

Anticuerpos biespecíficos de unión a digoxigenina

La presente invención se refiere a usos de anticuerpos biespecíficos y fragmentos de anticuerpos contra una proteina diana y una digoxigenina, como plataforma de administración para agentes terapéuticos o de diagnóstico que comprenden un ácido nucleico, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y usos de los mismos, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La medicina molecular requiere agentes que ¡nteracclonen específica y eficazmente con células diana. La eficaz administración /n v/vo de agentes terapéuticos o de diagnóstico funcionales a un tejido o célula diana todavía sigue siendo uno de los mayores obstáculos en el desarrollo de fármacos. Un enfoque es acoplar las cargas a un vehículo de administración que se dirige específicamente a células, por ejemplo, a un anticuerpo. Las cargas deben acoplarse con buena estabilidad para asegurar el direcclonamlento específico y evitar la liberación no específica sistèmica de la carga. Sin embargo, para permitir la entrada en la célula, la carga se libera Idealmente en o dentro de células diana. Combinar la buena estabilidad dentro de la circulación con la liberación eficaz en la diana es un cuello de botella importante en el desarrollo de conjugados. La mayoría de los conjugados del estado de la materia no consisten en un tipo de molécula definida, sino que son una mezcla de moléculas con diferentes cantidades de cargas acopladas en posiciones variables. Un inconveniente Importante de estos conjugados es que los procedimientos de conjugación necesitan adaptarse a cada anticuerpo y cada carga; por tanto, las cargas no pueden intercambiarse fácilmente, también el enlace covalente puede producir ¡nmunogenlcldad.

Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos recomblnantes en el pasado reciente, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos tetravalentes por fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios monocatenarios (véase, por ejemplo, Coloma, M.J., et al., Nature Blotech 15 (1997) 159-163; documento WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234). También se han desarrollado varios otros formatos nuevos en los que la estructura central del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no es retenida tal como dia-, tria- o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos monocatenarios (scFv, BIs-scFv), que pueden unirse a dos o más antígenos (Holliger P, et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126 - 1136; Fischer N., Léger O., Pathoblology 74 (2007) 3-14; Shen J, et al., Journal of Immunologlcal Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C. et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

Los anticuerpos biespecíficos son capaces de unirse simultáneamente a dos dianas diferentes y así también de administrar una gran variedad de cargas a los tejidos o células diana. Hasta la fecha se han descrito anticuerpos biespecíficos específicos para ciertas dianas de células. Sin embargo, esta metodología tiene una desventaja importante, ya que requiere que los anticuerpos se produzcan contra cada agente deseado para uso de diagnóstico y terapéutico.

El documento US 7.429.381 desvela un método de direccionamiento previo de dos etapas, en el que un anticuerpo biespecíflco específico para un hapteno de HSG y una proteina de la superficie celular se administra primero a la célula y a continuación se usa para capturar un hapteno de HSG con el que está quelado un catión terapéutico o de diagnóstico o un agente terapéutico o de diagnóstico. Los haptenos son moléculas pequeñas, tales como pesticidas, fármacos, hormonas y toxinas, que son normalmente no ¡nmunogénlcas, a menos que se acoplen a algunas macromoléculas tales como proteínas. Sin embargo, el uso de anticuerpos antl-hapteno de HSG biespecíficos en un método de direcclonamlento previo de dos etapas tiene varias limitaciones.

Song et al. (Nature, voi. 23, n° 6, 1, páginas 709-717) desvelan la administración /n v/vo de ARNIp por un complejo de anticuerpo-protamlna en el que el ARNIp está unido no covalentemente a la parte de protamlna de dicho complejo.

La principal desventaja es la complejidad del enfoque, que Implica la preparación y dosificación de dos reactivos separados y las consiguientes cuestiones de momento preciso y relación. Además, no es posible analizar el complejo resultante del anticuerpo biespecíflco y el agente terapéutico o de diagnóstico. Por tanto, es difícil predecir propiedades farmacológicas, estequlometría y posibles productos de degradación del agente terapéutico o de diagnóstico capturado por el anticuerpo biespecíflco.

Además, los conjugados actualmente usados no pueden aplicarse a la mayoría de los agentes terapéuticos, ya que la conjugación frecuentemente produce actividad reducida o eliminada del agente terapéutico o alteraciones no deseadas de las capacidades de unión del anticuerpo.

Por tanto, existe la necesidad de una plataforma de administración bien definida, eficaz y específica para agentes terapéuticos y de diagnóstico con liberación eficaz de la carga en la diana que puedan aplicarse ampliamente.

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo biespecíflco específico contra un hapteno y una proteina diana, que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a un hapteno y un segundo sitio de unión al antígeno

que se une a una proteína diana, en el que el hapteno está conjugado con un ácido nucleico. Haptenos preferidos son digoxigenina, biotina y polietilenglicol (PEG).

La invención proporciona métodos para producir los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos, además de métodos para usarlos, en particular su uso como plataforma de administración para agentes terapéuticos y de diagnóstico, además de composiciones farmacéuticas y herramientas de diagnóstico que comprenden dichos anticuerpos.

Realizaciones preferidas incluyen el uso de anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos contra una proteína diana y digoxigenina, que comprenden un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina (denominado "Dig" o "DIG") y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana. Dichos sitios de unión de los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos se denominan "<proteína diana>" (o brevemente, "<diana>")y"<Dig>", respectivamente.

La divulgación también se refiere a anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos contra una proteína diana y un hapteno diferente de digoxigenina. Haptenos preferidos son biotina y PEG.

Las realizaciones más adelante se ejemplifican para anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos contra una proteína diana y digoxigenina, además de métodos para usarlos, en particular su aplicación como una plataforma de administración. Aún cuando la digoxigenina sea el hapteno más preferido previsto en la presente invención, estas divulgaciones también son aplicables a biotina y PEG.

Adicionalmente, la presente divulgación se refiere a anticuerpos biespecíficos monoclonales y fragmentos de anticuerpos que comprenden un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, codificando los ADN tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y vectores para expresar los ADN. Preferentemente, dichos anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanizados y quiméricos.

En el presente documento se desvela un anticuerpo biespecífico que se une a digoxigenina y una proteína diana que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a digoxigenina y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteína diana, que comprende

a) un anticuerpo bivalente monoespecífico que consiste en dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa y dos cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa, por lo que cada cadena comprende solo un dominio variable,

b) dos conectores de péptido,

c) dos anticuerpos monocatenarios monovalentes monoespecíficos que consisten cada uno en un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo y un conector monocatenario entre dicho dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo;

y preferentemente dichos anticuerpos monocatenarios están ligados al mismo extremo (extremo C y N) de las cadenas pesadas del anticuerpo bivalente monoespecífico o, alternativamente al mismo extremo (preferentemente el extremo C) de las cadenas ligeras del anticuerpo bivalente monoespecífico, y más preferentemente al mismo extremo (extremo C y N) de las cadenas... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo biespecífico específico contra digoxigenina (DIG) y una proteina diana para su uso en terapia o diagnósticos, en el que un ácido nucleico que se ha conjugado con DIG se administra a una célula diana o tejido,

en el que el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a DIG que comprende un dominio variable de la cadena pesada seleccionado de SEC ID N°: 3, SEC ID N°: 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P o SEC ID N°: 2, y un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEC ID N°:5 o SEC ID N°: 1;

y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteina diana.

2. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo biespecífico comprende como fragmento Fd de la cadena pesada (VH y CHi) SEC ID N°: 4 o SEC ID N°: 36 y como cadena L SEC ID N°: 6 o SEC ID N°: 37.

3. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que la proteina diana es un antígeno de la superficie celular.

4. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3, en el que el antígeno de la superficie celular es un antígeno de tumor.

5. El anticuerpo para su uso según cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en el que la proteina diana está seleccionada del grupo de Her2, IGF1 R, CD22, CD33, LeY, VEGFR1, Fler2 (Lieberman).

6. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico es un agente terapéutico o de diagnóstico.

7. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico es ARN Scatenarlo.

8. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico está conjugado con un reactivo de transfección.

9. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 8, en el que el reactivo de transfección es un reactivo de transfección llposómlco o un péptldo de transfección.

10. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico se acopla a un policonjugado dinámico (DPC).

11. Una composición farmacéutica que comprende

un anticuerpo biespecífico o contra digoxigenina (DIG) y una proteina diana para la administración de un ácido nucleico a una célula o tejido diana para su uso en terapia o diagnósticos, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a DIG que comprende un dominio variable de la cadena pesada seleccionado de SEC ID N°: 3, SEC ID N°: 3 con las mutaciones S49A, I57A y A60P o SEC ID N°: 2 y un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEC ID N°: 5 o SEC ID N°: 1; y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a una proteina diana;

en la que dicho anticuerpo se acopla a un ácido nucleico terapéutico o de diagnóstico digoxigenado.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 para su uso en terapia gènica dirigida.