Aislamiento y purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con la proteína A.

Procedimiento para producir un anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno,

con un nivel reducido de proteína de célula huésped (HCP) a partir de una mezcla de muestra que comprende un anticuerpo, o parte del mismo de unión al antígeno, y al menos una HCP, y dicho procedimiento comprende:

(a) sometimiento de dicha mezcla de muestra a una reducción del pH, con lo que se forma una muestra de recuperación primaria en la que el pH de dicha mezcla de muestra se reduce hasta un pH de 3 a 4 para formar dicha muestra de recuperación primaria;

(b) ajuste de dicha muestra de recuperación primaria hasta un pH de 6,8 a 8, seguido de;

(c) puesta en contacto de dicha muestra de recuperación primaria con una resina cromatográfica de afinidad de proteína A, lavado de dicha reina cromatográfica de afinidad con un tampón seleccionado entre el grupo formado por: 1) un tampón que comprende NaCl 0,5 M, acetato sódico 25 mM, a pH 5; 2) un tampón que comprende NaCl 0,5 M, acetato sódico 25 mM, a pH 5,5; y 3) un tampón que comprende NaCl 0,5 M, ácido cítrico/citrato sódico 20 mM, a pH 6, y recolección de una muestra de cromatografía de afinidad;

(d) puesta en contacto de dicha muestra de cromatografía de afinidad con una resina de intercambio iónico y recolección de una muestra de intercambio iónico;

(e) puesta en contacto de dicha muestra de intercambio iónico con una resina de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y recolección de una muestra de HIC, en la que dicha muestra de HIC comprende dicha preparación de anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con un nivel reducido de HCP.

Aislamiento y purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con la proteína A 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] Los procedimientos de purificación para anticuerpos monoclonales para uso farmacéutico producidos mediante cultivo de fermentación suelen comprender cuatro etapas básicas. Estas etapas incluyen: (1) recolección/clarificación - separación de células huésped a partir del cultivo de fermentación; (2) captura - separación

10 de anticuerpo a partir de la mayoría de los componentes de la recolección clarificada; (3) purificación fina - eliminación de agregados y contaminantes de la célula huésped; y (4) formulación - Introducción del anticuerpo en un excipiente apropiado para aumentar al máximo la estabilidad y el periodo de validez.

[0002] Sin embargo, a menudo estas etapas no dan lugar necesariamente a composiciones de anticuerpos 15 con la suficiente pureza para su uso en contextos farmacéuticos. Actualmente existe la necesidad de contar con

procedimientos para producir y purificar un anticuerpo que resulte de Interés, en una forma lo suficientemente pura como para ser apta para un uso farmacéutico. La presente Invención está dirigida a satisfacer esta necesidad.

[0003] Ishlhara y col. (Journal of Chromatography, Elsevier Science Publishers B.V., 2007, vol. 1176, n. 1-2) 20 hacen referencia a un procedimiento de purificación de anticuerpos monoclonales, en el que se lleva a cabo una

reducción de pH antes de una cromatografía con proteína A.

[0004] Brorson y col. (Biotechnology and Bioengineering, 5 de mayo de 2003, vol. 82, n. ° 3) hacen referencia a una purificación de anticuerpos a partir de virus y HCP (proteína de célula huésped), en la que los procesos

25 Implican, en primer lugar, la disminución del pH, a continuación, una cromatografía de afinidad con proteína A y, después, una cromatografía de exclusión por tamaño.

[0005] El documento W008/07280 hace referencia a un polímero selectivamente soluble y con capacidad para ligarse a la blomolécula escogida en una mezcla que contiene diversos materiales biológicos, y a los

30 procedimientos para usar dicho polímero para purificar una biomolécula a partir de dicha mezcla.

[0006] El documento W095/22389 hace referencia a la aplicación de una cromatografía en combinación con cromatografía de interacción hidrófoba a la purificación de moléculas de proteínas de anticuerpos.

35 [0007] El documento W098/17786 proporciona procedimientos para inactivar virus en preparados de anticuerpos, por ejemplo preparados de anticuerpos monoclonales, mediante un suave calentamiento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

40 [0008] La presente invención hace referencia a un procedimiento para producir un preparado de anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con un nivel reducido de proteína de célula huésped (HCP, por sus siglas en inglés), a partir de una mezcla de muestra que comprende un anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, y al menos una HCP, comprendiendo dicho procedimiento:

45 (a) el sometimiento de dicha mezcla de muestra a una reducción en el pH, con lo que se forma una muestra de recuperación primaria, en el que el pH de dicha mezcla de muestra se reduce hasta un pH de 3 a 4 para formar dicha muestra de recuperación primaria;

(b) el ajuste del pH de dicha muestra de recuperación primaria hasta un valor de 6,0 a 8, seguido de;

(c) la puesta en contacto de dicha muestra de recuperación primaria con una resina de cromatografía de afinidad con proteína A, lavado de dicha resina de cromatografía de afinidad con un tampón seleccionado entre el grupo formado por: 1) un tampón que comprende NaCI 0,5M, acetato de sodio 25 mM, con pH 5; 2) un tampón que comprende NaCI 0,5M, acetato de sodio 25 mM, con pH 5,5; y 3) un tampón que comprende NaCI 0,5M, ácido

55 cítrico/citrato sódico 20 mM, con pH 6, y recolección de una muestra de cromatografía de afinidad;

(d) la puesta en contacto de dicha muestra de cromatografía de afinidad con una resina de intercambio iónico y recolección de una muestra de intercambio iónico;

(e) la puesta en contacto de dicha muestra de intercambio iónico con una resina de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y recolección de una muestra de HIC, en la que dicha muestra de HIC comprende dicho preparado de anticuerpo, o porción del mismo de unión a antígeno, con un nivel reducido de HCP.

5 [0009] La presente invención se ocupa de procedimientos para aislar y purificar anticuerpos a partir de una matriz de muestra. En ciertos aspectos, la invención se ocupa de procedimientos de purificación de anticuerpos en los que se emplea cromatografía de afinidad, preferentemente cromatografía de afinidad con proteína A. En ciertos aspectos, los procedimientos de la presente descripción emplean una etapa de inactivación ácida, una etapa de cromatografía de afinidad, y una o más etapas adicionales de cromatografía y/o filtración. Las etapas de 10 cromatografía pueden incluir una o más etapas de cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de interacción hidrófoba.

[0010] Una forma de realización de la presente invención se centra en un procedimiento de purificación de un anticuerpo o de su región de unión a partir de una matriz de muestra, de manera que la composición de anticuerpo

15 resultante esté sustancialmente exenta de proteínas de célula huésped («HCP»), En un aspecto, la matriz de muestra (o simplemente «muestra») comprende un cultivo de líneas celulares en el que la línea celular se emplea para producir anticuerpos específicos de la presente invención. En un aspecto particular, la matriz de muestra se prepara a partir de una línea celular usada para producir anticuerpos anti-IL-12; en otro aspecto, la matriz de muestra se prepara a partir de una línea celular usada para producir anticuerpos anti-TNFa; y en otro aspecto la 20 matriz de muestra se prepara a partir de una línea celular usada para producir anticuerpos anti-IL-18.

[0011] Un procedimiento de la presente invención incluye el sometimiento de una matriz de muestra, que comprende el anticuerpo putativo de interés o su región de unión, a un ajuste del pH. En un aspecto, el pH se ajusta para obtener un pH ácido. Como ejemplo, un pH adecuado está entre 3 y 5, preferentemente es un pH de 3,5. Esta

25 recuperación primaria se lleva a cabo, en parte, para reducir el nivel de virus sensibles al pH o inactivarlos. Además de reducir el nivel de virus y/o inactivarlos, las condiciones ácidas facilitan la eliminación de células y residuos celulares, con lo cual se forma una muestra de recuperación primaria. Tras un periodo de tiempo adecuado, se puede ajustar el pH hasta alcanzar un pH más neutro o básico y la muestra de recuperación primaria se somete a cromatografía de afinidad, preferentemente cromatografía de afinidad con proteína A. En un aspecto, la muestra de 30 cromatografía de afinidad se recolecta y se somete a posteriores etapas de cromatografía como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico y de interacción hidrófoba.

[0012] En una forma de realización, la etapa de cromatografía de afinidad comprende el sometimiento de la muestra de recuperación primaria a una columna que comprende un soporte cromatográfico adecuado para la

35 cromatografía de afinidad. Como ejemplos no exclusivos de dichos soportes cromatográficos, se pueden citar, entre otros, resina con proteína A, resina con proteína G, soportes de afinidad que comprenden el antígeno contra el cual se generó el anticuerpo de interés, y soportes de afinidad que comprenden una proteína con capacidad de unión al fragmento Fe. La resina con proteína A resulta útil para el aislamiento y la purificación por afinidad de anticuerpos (IgC). En un aspecto, una columna con proteína A se equilibra con un tampón adecuado antes de cargar la muestra. 40 Un ejemplo de tampón adecuado es un tampón Tris/NaCI, pH 7,2. Una vez equilibrada, la muestra se puede cargar en la columna. Tras cargar la muestra en la columna, la columna se puede lavar una o más veces con, por ejemplo, el tampón empleado en el equilibrado. Antes de la elución de la columna, se pueden llevar a cabo otros lavados, incluidos lavados en los que se emplean diferentes tampones. A continuación, se puede llevar a cabo la elución de la columna con proteína A usando un tampón de elución adecuado. Un ejemplo de tampón de elución adecuado es 45 un tampón de ácido acético/NaCI, pH 3,5 aproximadamente. El eluido se puede determinar usando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un seguimiento de la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir un anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con un nivel reducido de proteína de célula huésped (HCP) a partir de una mezcla de muestra que comprende un anticuerpo, o parte del mismo de unión al antígeno, y al menos una HCP, y dicho procedimiento comprende:

(a) sometimiento de dicha mezcla de muestra a una reducción del pH, con lo que se forma una muestra de recuperación primarla en la que el pH de dicha mezcla de muestra se reduce hasta un pH de 3 a 4 para formar dicha muestra de recuperación primarla;

(b) ajuste de dicha muestra de recuperación primarla hasta un pH de 6,8 a 8, seguido de;

(c) puesta en contacto de dicha muestra de recuperación primaria con una resina cromatográfica de afinidad de proteína A, lavado de dicha reina cromatográfica de afinidad con un tampón seleccionado entre el grupo formado

por: 1) un tampón que comprende NaCI 0,5 M, acetato sódico 25 mM, a pH 5; 2) un tampón que comprende NaCI 0,5 M, acetato sódico 25 mM, a pH 5,5; y 3) un tampón que comprende NaCI 0,5 M, ácido cítrico/citrato sódico 20 mM, a pH 6, y recolección de una muestra de cromatografía de afinidad;

(d) puesta en contacto de dicha muestra de cromatografía de afinidad con una resina de intercambio iónico y 20 recolección de una muestra de Intercambio iónico;

(e) puesta en contacto de dicha muestra de intercambio iónico con una resina de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y recolección de una muestra de HIC, en la que dicha muestra de HIC comprende dicha preparación de anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con un nivel reducido de HCP.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha reducción de pH se logra mezclando un ácido adecuado con dicha mezcla de muestra, y en el que dicho ácido adecuado se selecciona entre el grupo formado por ácido cítrico, ácido acético y ácido caprílico.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catlónico.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha resina de intercambio iónico es una resina de intercambio anlónlco.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha resina de HIC comprende una matriz sustituida, en la que los sustltuyentes consisten en uno o más grupos hidrófobos.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende una etapa de filtración, en la que 40 dicha muestra de HIC se somete a filtración para eliminar partículas víricas y para facilitar el intercambio de tampones.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de anticuerpo, o porción del mismo de unión al antígeno, con nivel reducido de HCP comprende o un anticuerpo antl-IL-12, o una porción del

45 mismo de unión al antígeno, o bien un anticuerpo anti-TNFa, o una porción del mismo de unión al antígeno.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo antl-IL-12, o porción del mismo de unión al antígeno, es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido o un anticuerpo multlvalente.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo antl-TNFa, o porción del mismo de unión al antígeno, es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo híbrido o un anticuerpo multlvalente.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación está sustanclalmente exenta de HCP.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende una filtración en profundidad.