Agregación dependiente de secuencia.

Método para proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas

a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de una inmunoglobulina con la secuencia de referencia xxxxTxxTxxx (SEC ID Nº 11) para conseguir el nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos,

b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con un pequeño resto de aminoácido hidrófobo o no polar en la posición 5 o/y 8 en la cuarta región flanqueante de cadena pesada,

c) modificar la inmunoglobulina sustituyendo un resto de aminoácido en la cuarta región flanqueante de cadena pesada en una posición identificada en b), que es treonina en la secuencia de referencia, y que no es treonina en la cuarta región flanqueante de cadena pesada, por el respectivo resto de treonina como en la secuencia de referencia,

d) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina.

Agregación dependiente de secuencia

En este documento se presenta un método para reducir la agregación de inmunoglobulina en soluciones concentradas revertiendo una o dos mutaciones en la cuarta región flanqueante, es decir, en el elemento-J, de una cadena pesada de inmunoglobulina al resto de aminoácido de línea germinal hidrófilo o natural.

Antecedentes de la invención

Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como peso molecular y arquitectura de dominio Incluyendo modificaciones secundarlas, el procesamiento corriente abajo de las inmunoglobullnas es muy complicado. Las soluciones concentradas de inmunoglobulina son necesarias no solamente para fármacos formulados sino también para intermedios en procesamiento corriente abajo (DSP) para conseguir bajos volúmenes para manipulación económica y almacenamiento de aplicación.

También la formulación final de la inmunoglobulina requiere una solución altamente concentrada. Por ejemplo, para aplicación subcutánea se requieren concentraciones de inmunoglobulina de más de 1 mg/ml, es decir, aproximadamente 15 mg/ml. Pero al menos algunas inmunoglobulinas tienden a agregarse a concentraciones no fisiológicamente altas de 1 mg/ml o más.

En el documento WO 29/98 se presenta una secuencia basada en modificación por ingeniería y optimización de anticuerpos de cadena sencilla.

Sumario de la invención

En este documento se presenta un método para reducir la agregación de inmunoglobulinas en una solución concentrada. Se ha descubierto que dos incluso una única mutación de reversión en la cuarta región flanqueante de una cadena pesada de inmunoglobulina puede reducir la formación de agregados permitiendo proporcionar una solución altamente concentrada de la vahante de inmunoglobulina revertida con contenido reducido de agregados. Por lo tanto, en este documento se presentan como aspectos individuales un método para reducir la agregación de una Inmunoglobulina en solución, un método para modificar una Inmunoglobulina, un método para producir una inmunoglobulina, y un método para humanizar una inmunoglobulina.

Todos los métodos presentados en este documento comprenden las siguientes etapas:

a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta reglón flanqueante de cadena pesada de una inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos de referencia para conseguir un nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos,

b) identificar las posiciones de la secuencia de aminoácidos alineada con diferentes restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la cuarta reglón flanqueante de cadena pesada de la Inmunoglobulina y la secuencia de aminoácidos de referencia xxxxTxxTxxx (SEC ID N° 11),

c) modificar la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina sustituyendo uno o al menos un resto de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarte reglón flanqueante de cadena pesada de la Inmunoglobulina en la posición 5 y/u 8 para el resto respectivo de treonina presente en la secuencia de aminoácidos de referencia, en la cual en la posición sustituida el resto de aminoácido sea treonina en la secuencia de aminoácidos de referencia, y en la cual el resto de aminoácido no es treonina y no es serlna en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina,

d) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de Inmunoglobulina modificada.

En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de referencia es la secuencia de aminoácidos xxxxTxxTxxx (SEC ID N° 11) indicando x en las posiciones 1, 2, 3, 4, 7 y 9 cualquier resto de aminoácido excepto treonina y serina e indicando x en la posición 6 treonina e indicando x en la posición 1 y 11 serina, en la cual la diferencia de restos treonina en la posición 5 y/u 8 en la secuencia de aminoácidos de referencia respecto a la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de inmunoglobulina se identifica en la etapa b) y se modifica en la etapa c). En una realización de todos los aspectos presentados en este documento los métodos comprenden las siguientes etapas:

a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEC ID N° 2), o la secuencia de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEC ID N° 3), o la secuencia de aminoácidos WGQGTMVTVSS (SEC ID N° 4), o la

secuencia de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEC ID N° 5), o la secuencia de aminoácidos WGKGTTVTVSS (SEC ID N° 6) para conseguir un nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos,

b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con diferentes restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina y la secuencia de aminoácidos de referencia,

c) modificar la inmunoglobulina sustituyendo un resto de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada en la posición 5 o/y 8 para el resto de treonina respectivo presente en la secuencia de aminoácidos de referencia, en la cual el resto de aminoácido en la posición es treonina en la secuencia de aminoácidos de referencia y en la cual el resto de aminoácido en la posición no es treonina y no es serina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina,

d) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina modificada.

En una realización de los aspectos presentados en este documento, los métodos comprenden como primera etapa la etapa de proporcionar o determinar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de la cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la secuencia de referencia es la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEC ID N° 2). En una realización solamente se determina y cambia la diferencia de restos de treonina.

En un aspecto presentado en este documento el método es un método para producir una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas:

a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos de referencia xxxxTxxTxxx (SEC ID N° 11) para conseguir un nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos,

b) identificar las posiciones de la secuencia de aminoácidos alineada con diferentes restos de aminoácido en la posición 5 y/u 8 11 en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina y la secuencia de aminoácidos de referencia,

c) modificar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina sustituyendo un resto de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada en una posición identificada en b) para el respectivo resto de treonina como en la secuencia de aminoácidos de referencia, en la cual el resto de aminoácido en la posición es treonina en la secuencia de aminoácidos de referencia, y en la cual el resto de aminoácido en la posición no es treonina y no es serina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina,

d) cultivar una célula de mamífero que comprenda el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de inmunoglobulina modificada y un ácido nucleico que codifica una correspondiente secuencia de aminoácidos de cadena ligera para la expresión de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina,

e) recuperar la inmunoglobulina de la célula de mamífero o del medio de cultivo y producir de ese modo una inmunoglobulina.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de referencia es la secuencia de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEC ID N° 2), o la secuencia de aminoácidos WGRGTLVTVSS (SEC ID N° 3), o la secuencia de aminoácidos WGQGTMVTVSS (SEC ID N° 4), o la secuencia de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEC ID N° 5), o la secuencia de aminoácidos WG-KGTTVTVSS (SEC ID N° 6). La etapa de modificar la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina es sustituir un resto de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada en una posición identificada en b), que es treonina en la secuencia de aminoácidos de referencia y que no es treonina en la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada, por el respectivo resto de treonina presente en la secuencia de aminoácidos de referencia. En otra realización la modificación... [Seguir leyendo]

1. Método para proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas

a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de una inmunoglobulina con la secuencia de referencia xxxxTxxTxxx (SEC ID N° 11) para conseguir el nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos,

b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con un pequeño resto de aminoácido hidrófobo o no polar en la posición 5 o/y 8 en la cuarta región flanqueante de cadena pesada,

c) modificar la inmunoglobulina sustituyendo un resto de aminoácido en la cuarta región flanqueante de cadena pesada en una posición identificada en b), que es treonina en la secuencia de referencia, y que no es treonina en la cuarta región flanqueante de cadena pesada, por el respectivo resto de treonina como en la secuencia de

referencia,

d) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina.

2. Método para producir una inmunoglobulina que comprende las siguientes etapas

a) alinear la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de la inmunoglobulina con la secuencia de referencia xxxxTxxTxxx (SEC ID N° 11) para conseguir el nivel máximo de identidad de secuencia de aminoácidos,

b) identificar las posiciones de aminoácidos alineadas con un pequeño resto de aminoácido hidrófobo o no polar en la posición 5 o/y 8 en la cuarta región flanqueante de cadena pesada,

c) modificar la inmunoglobulina sustituyendo un resto de aminoácido en la cuarta región flanqueante de cadena pesada en una posición identificada en b), que es treonina en la secuencia de referencia, y que no es treonina en la cuarta región flanqueante de cadena pesada, por el respectivo resto de treonina como en la secuencia de referencia,

d) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina modificada,

e) cultivar una célula de mamífero que comprende el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de inmunoglobulina modificada y un ácido nucleico que codifica una correspondiente secuencia de aminoácidos de cadena ligera para la expresión de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina,

f) recuperar la inmunoglobulina de la célula de mamífero o el medio de cultivo y producir de ese modo una inmunoglobulina.

3. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la secuencia de referencia es la secuencia WGQGTLVTVSS (SEC ID N° 2), o la secuencia WGRGTLVTVSS (SEC ID N° 3), o la secuencia WGQGT-MVTVSS (SEC ID N° 4), o la secuencia WGQGTTVTVSS (SEC ID N° 5), o la secuencia WGKGTTVTVSS (SEC ID N° 6).

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el método comprende una primera etapa que proporciona o determina la secuencia de aminoácidos de la cuarta región flanqueante de cadena pesada de inmunoglobulina.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana o humanizada.

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica, o una inmunoglobulina de CDR-injertada, o una inmunoglobulina con epítopo de célula-T empobrecido, o una variante de las mismas.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado por que la célula de mamífero es una célula CHO o una célula HEK.