Agentes de unión del receptor Notch1 y procedimientos de uso de los mismos.

Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una región proximal de la membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notch1 humano,

que comprende:

(a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende RGYWIE (SEQ ID NO: 15), una CDR2 de la cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16) y una CDR3 de la cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17); y

(b) una CDR1 de la cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), una CDR2 de la cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEQ ID NO: 19) y una CDR3 de la cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20).

Agentes de unión del receptor Notchl y procedimientos de uso de los mismos 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención

[1] La presente divulgación se refiere a composiciones que comprenden un agente que se une a un 1 receptor Notch humano y procedimientos de uso de las composiciones para caracterizar, diagnosticar y tratar cáncer y otras enfermedades. En particular, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una región proximal de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhiben el crecimiento tumoral. La presente divulgación proporciona además procedimientos para tratar cáncer, comprendiendo los procedimientos administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une 15 específicamente a una región proximal de la membrana de unión no de ligando del dominio extracelular de una proteína del receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento tumoral.

Antecedentes

[2] El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, produciendo más de 5. muertes por año en los Estados Unidos solo. Más de un millón de personas se diagnostican con cáncer en los EE UU, cada año, y en general se estima que más de 1 de cada 3 personas desarrollarán alguna forma de cáncer durante su vida. Aunque existen más de 2 tipos diferentes de cáncer, cuatro de ellos, de mama, pulmón, colorrectal y de próstata, representan más de la mitad de todos los nuevos casos (Jemal y col., 23, Cáncer J. Clin 25 53:5-26).

[3] El cáncer surge de la desregulación de los mecanismos que controlan el desarrollo y el mantenimiento tisular normal, y se cree que las células madre en aumento desempeñan una función central (Beachy y col., 24, Nature 432:324). Durante el desarrollo normal de los animales, las células de la mayoría o todos los tejidos se

derivan de precursores normales, llamados células madre (Morrison y col., 1997, Cell 88:287-98; Morrison y col., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21; Morrison y col., 1995, Annu. Rev. Cell Dev. Biol 11:35-71). Las células madre son células que: (1) tienen una extensa capacidad proliferativa; (2) son capaces de división celular asimétrica para generar uno o más tipos de progenie con potencial proliferativo y/o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de divisiones celulares simétricas para la auto-renovación o auto-mantenimiento. El ejemplo más conocido de la 35 renovación de células en adultos por la diferenciación de células madre es el sistema hematopoyético en el que los precursores en desarrollo inmaduros (células madre y progenitoras hematopoyéticas) responden a las señales moleculares para formar los tipos de células sanguíneas y linfoides variables. Otras células, incluyendo células del intestino, células de los conductos de la mama y la piel, se reponen constantemente de una pequeña población de células madre en cada tejido, y estudios recientes sugieren que la mayor parte de los otros tejidos en adultos 4 también alojan células madre, incluyendo el cerebro.

[4] Los tumores sólidos están compuestos de poblaciones celulares heterogéneas. Por ejemplo, los cánceres de mama son una mezcla de células cancerígenas y células normales, incluyendo células mesenquimatosas (del estroma), células inflamatorias y células endotellales. Los modelos clásicos de cáncer

soportan que todas las poblaciones de células cancerígenas fenotíplcamente diferentes tengan la capacidad de proliferar y dar origen a un nuevo tumor. En el modelo clásico, la heterogeneidad de las células tumorales resulta de factores ambientales, además de mutaciones en curso dentro de las células cancerígenas que producen una población diversa de células tumorigénicas. Este modelo se basa en la ¡dea de que todas las poblaciones de células tumorales tendrían algún grado de potencial tumorlgénlco (Pandls y col., 1998, Genes, Chromosomes & Cáncer 5 12:122-129; Kuukasjrvi y col., 1997, Cáncer Res. 57:1597-164; Bonslng y col., 1993, Cáncer 71:382-391; Bonslng y col., 2, Genes Chromosomes & Cáncer 82 : 173-183; Beerman H y col., 1991, Cytometry 12:147-54; Aubele M & Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path 19:53; Shen Ly col., 2, Cáncer Res. 6:3884).

[5] Un modelo alternativo para la heterogeneidad de células de tumor sólido observada es que los tumores 55 sólidos resultan de una célula madre de tumor sólido (o célula madre cancerígena de un tumor sólido) que

posteriormente experimenta el desarrollo caótico a través de tanto rondas simétricas como asimétricas de las divisiones celulares. En este modelo de célula madre, los tumores sólidos contienen un subconjunto diferente y limitado (posiblemente incluso raro) de células que comparten las propiedades de las células madre normales, porque proliferan ampliamente y eficazmente dan lugar a tanto células madre de tumor sólido adicionales (auto-

renovación) como a la mayor parte de las células tumorales de un tumor sólido que carecen de potencial tumorigénico. De hecho, las mutaciones dentro de una población de células madre que viven mucho tiempo pueden iniciar la formación de células madre cancerígenas que se basan en el crecimiento y mantenimiento de tumores y cuya presencia contribuye al fallo de los actuales enfoques terapéuticos.

[6] La naturaleza de la célula madre de cáncer se reveló por primera vez en el cáncer de la sangre, leucemia mieloide aguda (LMA) (Lapidot y col., 1994, Nature 367:645-8). Más recientemente se ha demostrado que los tumores de mama humanos malignos alojan similarmente una pequeña población diferente de células madre cancerígenas enriquecidas en la habilidad de formar tumores en ratones inmunodeficientes. Se encontró que una

población de células ESA+, CD44+, CD24-/bajo, Un está 5 veces más enriquecida en células tumorigénicas en comparación con células tumorales no fraccionadas (Al-Hajj y col., 23, PNAS 1:3983-8). La capacidad de aislar prospectivamente las células cancerígenas tumorigénicas ha permitido la investigación de rutas biológicas críticas que subyacen la tumorigenicidad en estas células, y así promete el desarrollo de mejores ensayos de diagnóstico y terapéuticos para pacientes con cáncer. Es hacia este propósito al que se dirige esta invención.

[7] Las células madre normales y las células madre cancerígenas comparten la capacidad de proliferar y auto-renovarse, así no es sorprendente que varios genes que regulan el desarrollo de las células madre normales contribuyan a la tumorigénesis (revisado en Reya y col., 21, Nature 414:15-111 y Taipale & Beachy, 21, Nature 411:349-354). La presente divulgación identifica el receptor Notch, por ejemplo, Notchl, como un marcador

de células madre cancerígenas, que participa en la ruta de señalización de Notch en el mantenimiento de células madre cancerígenas y como una diana para tratar cáncer mediante la eliminación de estas células tumorigénicas.

[8] La ruta de señalización de Notch es uno de varios reguladores críticos de la formación del patrón embrionario, mantenimiento del tejido post-embrionario y la biología de la célula madre. Más específicamente, la

señalización de Notch participa en el proceso de la inhibición lateral entre los destinos de la célula adyacente y desempeña una función importante en la determinación del destino de la célula durante las divisiones celulares asimétricas. La señalización de Notch no regulada está asociada a numerosos cánceres humanos en los que puede alterar el destino del desarrollo de las células tumorales para mantenerlas en un estado no diferenciado y proliferatlvo (Brennan y Brown, 23, Breast Cáncer Res. 5:69). Así, la carcinogénesis puede avanzar usurpando los

mecanismos homeostátlcos que controlan el desarrollo normal y la reparación tisular por poblaciones de células madre (Beachy y col., 24, Nature 432:324).

[9] El receptor Notch se Identificó por primera vez en mutantes de Drosophila con haploinsuficiencia dando produciendo muescas en el margen del ala, mientras la pérdida de la función produce un fenotipo neurogénico letal

embrionario en el que las células de la epidermis cambian el destino hacia el tejido neural (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 194, J. Exp. Zool. 83:271). El receptor Notch es un receptor de transmembrana de un solo paso que contiene numerosas repeticiones similares a factor de crecimiento epidérmico (EGF) en tándem y tres repeticiones Notch/LIN-12 ricas en clsteína (LNR) dentro de un gran dominio extracelular (Wharton y col., 1985, Cell 43:567; Kidd y col., 1986, Mol. Cell Blol. 6:394; revisado en Artavanls y col., 1999,

Science 284:77). Las LNR y... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una región proximal de la membrana de unión no de ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, que comprende:

(a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende RGYWIE (SEQ ID NO: 15), una CDR2 de la cadena pesada que comprende QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16) y una CDR3 de la cadena pesada que comprende FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17); y

(b) una CDR1 de la cadena ligera que comprende RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), una CDR2 de la cadena ligera que comprende GTNNRAP (SEQ ID NO: 19) y una CDR3 de la cadena ligera que comprende ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 2).

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende:

(a) una región variable de la cadena pesada que tiene al menos el 9 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 24 y una región variable de la cadena ligera que tiene al menos el 9 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 32; o

(b) una región variable de la cadena pesada que tiene al menos el 9 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14 y una región variable de la cadena ligera que tiene al menos el 9 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo 25 quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo

biespecífico, un anticuerpo monoespecífico, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo lgG1 o un anticuerpo lgG2.

4. El anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende las mismas regiones variables de la cadena pesada y ligera que un polipéptido codificado por un plásmldo depositado como la designación de depósito de

patente ATCC PTA-9549.

5. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y un polipéptido que tiene la secuencia 35 de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 32; o

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

6. El anticuerpo según la reivindicación 5, que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

7. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un polipéptido que

tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de

SEQ ID NO: 26 ó 3.

8. El anticuerpo codificado por el polinucleótido depositado en la ATCC como PTA-9549.

9. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 codificado por un polinucleótido que

comprende SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 25 ó 29.

1. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Una célula huésped:

(a) que produce el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; o

(b) que comprende la molécula de polinucleótido según la reivindicación 1.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de una

enfermedad.

14. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de

cáncer.

15. Uso del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

16. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso según la reivindicación 15 14 o el uso según la reivindicación 15, en el que el tratamiento reduce la tumorigenicidad de un tumor y/o reduce la

frecuencia de células madre cancerígenas en un tumor.

17. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso según la reivindicación 14 o la reivindicación 16 o el uso según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el cáncer está

seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, glioblastoma y cáncer de cabeza y cuello.

18. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso según una cualquiera de 25 las reivindicaciones 14, 16 ó 17 o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el

tratamiento comprende administrar el anticuerpo, y comprende además administrar al sujeto un tratamiento adicional para el cáncer;

preferentemente en el que el tratamiento adicional para el cáncer es radioterapia, quimioterapia, o un anticuerpo 3 terapéutico adicional.