Procedimiento y dispositivo de vitrificación de material biológico mediante microcapilares de polímeros termoplásticos cerrados utilizando un recalentamiento ultra-rápido.

El dispositivo de vitrificación de material biológico mediante microcapilares de polímeros termoplásticos cerrados utilizando un recalentamiento ultra-rápido,

objeto de la presente invención, consiste en un contenedor compuesto por varias partes, fabricado en polímero termoplástico, optimizado como sistema cerrado para los procedimientos de criopreservación, para obtener, junto con el procedimiento reivindicado, velocidades de recalentamiento ultra-altas.

Procedimiento y dispositivo de vitrificación de material biológico mediante microcapilares de polímeros termoplásticos cerrados utilizando un recalentamiento ultra-rápido.

OBJETO DE LA INVENCiÓN

El dispositivo objeto de la presente invención consiste en un contenedor compuesto por varias partes, fabricado en polímero termoplástico, optimizado como sistema cerrado para los procedimientos de criopreservación, para obtener, junto con el procedimiento reivindicado, velocidades de recalentamiento ultra-altas.

El procedimiento y el dispositivo se encuadran en el sector de la técnica dedicado a la biotecnología y a la biomedicina. Es de aplicación en todos los procesos relacionados con la manipulación y tratamiento de material biológico a nivel celular. Y más en concreto, en los procesos relacionados con la conservación de este material biológico en condiciones que permitan su uso posterior tras un tiempo indefinido de almacenamiento a temperaturas criogénicas. En particular, este procedimiento y dispositivo son de especial utilidad para la criopreservación de ovocitos humanos en condiciones de máxima seguridad biológica (dispositivo cerrado) y máxima tasa de supervivencia de los ovocitos, similar a la de los dispositivos abiertos actuales, tras el recalentamiento (velocidad de recalentamiento ultra-alta) .

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las principales técnicas empleadas para conseguir la conservación celular se basan en la utilización de bajas temperaturas para ralentizar y detener las reacciones bioquímicas responsables del envejecimiento y deterioro del material biológico. Dentro de estas técnicas, las más ampliamente utilizadas son las llamadas de enfriamiento lento y las de vitrificación, con un gran número de variantes en ambos casos.

El enfriamiento lento es hasta ahora el procedimiento más usado [15, 17]. Se basa en el control de la velocidad de enfriamiento con el fin de crear un delicado equilibrio entre los distintos factores que causan daño celular, entre los que se encuentran la formación de hielo, fracturas y una excesiva deshidratación. Es sin embargo la otra técnica, la vitrificación, descrita a continuación y desarrollada en detalle a lo largo del resto de este apartado, la tecnología que ahora nos ocupa.

La vitrificación es un proceso mediante el cual un líquido se solidifica en una fase no cristalina (fase vítrea) [6]. Para conseguirla, en el caso de la vitrificación celular, se obliga a: i) un aumento en la viscosidad (mediante la sustitución del agua por agentes vitrificantes) y, sobre todo, ii) usando un rápido descenso de la temperatura de la célula (generalmente sumergiendo la muestra en nitrógeno liquido) . Este enfriamiento rápido de la muestra impide que las moléculas de agua tengan tiempo de ordenarse para crear la estructura cristalina del hielo, formando por lo tanto un sólido amorfo. La mayoría de las sustancias que se mantienen en estado líquido en un amplio rango de temperaturas vitrifican al ser enfriadas, y el resto de sustancias también vitrifican si el enfriamiento es suficientemente rápido. La vitrificación elimina completamente la aparición de cristales de hielo, los cuales suponen el mayor obstáculo para la criopreservación de células vivas [34]. Esta técnica ha mejorado en gran medida los resultados obtenidos por el enfriamiento lento, aunque todavía es insuficiente para la criopreservación en contenedores cerrados de determinados tipos celulares, como es el caso de los ovocitos [7], o de las células madre [8], en donde la sensibilidad celular exige una mejora de los métodos utilizados en la actualidad.

i) Para aumentar la viscosidad se han probado distintas combinaciones de agentes vitrificantes, también llamados crioprotectores. No es objeto de la presente invención la optimización o propuesta de alguna forma de agente vitrificante en concreto. En general, en el caso de ovocitos, los mejores se resultados hasta la fecha parecen obtenerse mediante el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) y el etilenglicol (EG) [24].

ii) Par conseguir una alta velocidad de enfriamiento de la célula, esta se suele sumergir en nitrógeno líquido. Del dispositivo y procedimiento utilizado para enfriar la muestra depende críticamente la velocidad de enfriamiento, habiéndose probado el uso de mezclas criogénicas distintas al nitrógeno liquido [16], la vitrificación sobre superficies sólidas[2, 5], etc... Hay dos grandes grupos de dispositivos y procedimientos: a) los que se basan en contenedores cerrados y b) los que se basan en contenedores abiertos.

a) Los que se basan en contenedores cerrados no permiten obtener, hasta la fecha, altas tasas de supervivencia en el caso particular de ovocitos. Sin embargo, sí son empleados con frecuencia para otros tipos celulares, como embriones, donde aquí los resultados sí son satisfactorios. La filosofía tras estos contenedores es la utilización de altas concentraciones de agentes vitrificantes y la utilización de un enfriamiento rápido de la muestra [3, 35].

b) Los que se basan en contenedores abiertos sí consiguen una alta tasa de supervivencia de ovocitos. Son los que de hecho se están utilizando en la actualidad para la conservación de óvulos [2, 4, 5, 10, 12, 13, 14, 20, 32, 33, 35]. En estos contenedores el ovocito se coloca sobre una superficie generalmente plana y siempre abierta. El ovocito queda unido a esta plataforma gracias al uso de un medio muy viscoso, usualmente rico en azucares que, a modo de melaza, lo mantiene físicamente pegado a esta. Tras ello, y para conseguir la máxima velocidad de enfriamiento, se retira todo el medio sobrante que pueda recubrir el ovocito, quedando el ovocito al descubierto; por ello estas técnicas se llaman técnicas de mínimo volumen, pues la filosofía tras ella es la de minimizar el volumen de la muestra a vitrificar. Como es mínimo el volumen de muestra que está en contacto con el nitrógeno líquido, ello hace que la velocidad de enfriamiento sea muy alta. Sin embargo estos contenedores abiertos, que sí permiten la vitrificación de ovocitos, generan un doble problema, por su naturaleza de abiertos: a) Por un lado, al estar abierto, la muestra corre riesgo de pérdida en su manipulación (en la entrada en el nitrógeno liquido, durante el tiempo de almacenamiento en la cántara de almacenaje o durante el recalentamiento posterior cuando se procede a su introducción dentro de de una gota de medio de recalentamiento; b) Pero, sobre todo, el mayor problema asociado al uso de contenedores abiertos es el riesgo potencial de contaminación [9, 19] (al entrar la muestra en contacto con el nitrógeno líquido) , ya sea contaminación vírica, bacteriana, o de cualquier otro tipo.

Sin embargo, recientemente ha habido un cambio de paradigma en la vitrificación de ovocitos: no es cuestión de mínimo volumen ni de maximizar la velocidad de enfriamiento; se trata, realmente, de maximizar la velocidad de recalentamiento. Se ha probado cómo velocidades de enfriamiento muy bajas (95 °C/min) pueden dar tasas de recuperación de ovocitos muy altas SIEMPRE Y CUANDO la velocidad de RECALENTAMIENTO sea suficientemente alta [18, 28, 29, 30, 31]

La presente invención no está basada en una técnica de mínimo volumen o en una alta velocidad de enfriamiento, sino en una velocidad de recalentamiento ultra-alta. La combinación del dispositivo y procedimiento reinvindicados consigue velocidades de recalentamiento por encima de 200.000 °C/min (Fig. 9) . Obviamente, la ventaja del uso de un contenedor cerrado con la misma tasa de recuperación de ovocitos que la de los contenedores abiertos es doble: a) por un lado evita la eventual pérdida del ovocitos, pero, b) sobre todo, elimina la posibilidad de contaminación (vírica, bacteriana o de cualquier otro tipo) de la muestra, al no estar nunca en contacto con el nitrógeno liquido.

Por tanto, y en resumen, la patente de invención objeto de la presente memoria se refiere a un nuevo procedimiento y dispositivo de criopreservación de material biológico en general y de ovocitos en particular, con las siguientes dos particularidades:

1) El almacenamiento del ovocito se produce en un contenedor cerrado que consigue la vitrificación de las muestras con unas tasas de recuperación iguales o superiores a las de cualquier dispositivo abierto. El procedimiento se basa en el uso de un microcapilar de polímeros termoplásticos de reducidas dimensiones y cerrado por ambos extremos, llamado SafeSpeed.

2) la principal característica de este procedimiento y dispositivo es que, siendo cerrado, garantiza una velocidad de recalentamiento por encima de 200.000 °C/min (Fig. 9) . Es la velocidad de recalentamiento, y no la velocidad de enfriamiento o el volumen mínimo de la muestra, como ocurre...

1. Procedimiento de criopreservación de material biológico mediante vitrificación, caracterizado por el uso de microcapilares poliméricos termoplásticos como contenedores del material biológico, introducidos en fluidos criogénicos para conseguir la vitrificación de la muestra biológica.

2. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de microcapilares poliméricos termoplásticos fabricados con policarbonato, o con cualquier otro material termosellable, con una conductividad térmica similar o superior.

3. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de microcapilares poliméricos termoplásticos termosellables, para evitar la contaminación cruzada de la muestra y que éste quede completamente aislada del exterior.

4. Procedimiento de criopreservación celular según las reivindicaciones 1-3 en las cuales las células a criopreservar son ovo citos , para los que se necesita una alta velocidad de recalentamiento para asegurar su viabilidad posterior.

5. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra celular se introduce previamente bañada en agentes crioprotectores en el interior del microcapilar, a distintas concentraciones dependiendo del tipo celular a criopreservar.

6. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, en el que el microcapilar polimérico termoplástico está ensamblado sobre un conjunto de pajuelas que le proporcionan rigidez y facilidad en el uso, no desmontables

7. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1 y 5, en el que una de las pajuelas actúa de protector del microcapilar en su posición de almacenamiento, móvil pero no desmontable.

8. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1 y 5, en el que una de las pajuelas es plana para facilitar la escritura e identificación de los datos del paciente.

9. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, en el que el microcapilar es introducido en fluidos criogénicos con la parte inferior del microcapilar conteniendo la muestra biológica sin el protector del capilar exterior, para optimizar el proceso de enfriamiento.

10. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de un baño de recalentamiento para el proceso de recalentamiento, en el que el microcapilar polimérico termoplástico termosellado, es introducido con la parte inferior conteniendo la muestra biológica, sin el protector del capilar exterior, para optimizar el proceso de recalentamiento.

11. Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de agua a 37 oC o de un fluido similar para el baño de recalentamiento.

12. Procedimiento de criopreservación celular según las reivindicaciones 1, 3, 5 Y 11 en la que, durante el recalentamiento, la distancia entre el baño de nitrógeno líquido y el baño con agua a 37 oC es del orden o menor a 1 cm.

13. Procedimiento de criopreservacion celular según la reivindicación 12 en la que si el tiempo de vuelo entre la salida del baño de nitrógeno liquido y la entrada en el baño de agua a 37 oC es inferior a 0.5 segundos, la velocidad de recalentamiento alcanza fácilmente el valor de 200.000 °C/min, lo que garantiza la viabilidad celular en el caso de ovocitos.

FIGURA 1

PAJUELA PRINCIPAL

ZONA DE

MICROCAPILAR

ESCRITURA

HENDIDURA

I ,

/14 (;/7 (31211.

POSTIZO

PAJUELA

PROTECTOR

EXTERIOR

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA4A

FIGURA4B

FIGURA4C

::n

o • -+ o t

==~~OF==========---+ -4t===~o============-

t

FIGURA4D

FIGURA5A

-

-

FIGURA 58

STOCK

FIGURA 6

.0 LN2

FIGURA 7

FIGURA8A

~~

-~-----

FIGURA 88

FIGURA8e

TiI!mpo (s)

FIGURA 9

FIGURA 10A

/

FIGURA 10B

Su pervivencia

FIGURA 11