Vehículo de administración para bacterias probióticas que comprende una matriz seca de polisacáridos, sacáridos y polioles en forma vítrea.

Una composición seca en forma vitrea solida adecuada para su administración oral,

comprendiendo la composición una mezcla que incluye al menos un polisacarido, un sacarido, un poliol y bacterias probióticas, en la que el sacarido es trehalosa y la proporción entre el sacarido y el polio! es 3:1 a 1:3.

Vehiculo de administracion para bacterias probioticas que comprende una matriz seca de polisacaridos, sacaridos y

polioles en forma vitrea.

Antecedentes de la divulgacion

LadivulgaciOn versa en general sobre el campo de un vehiculo de administracion de bacterias probioticas que comprende una matriz seca de polisacaridos, sacaridos y polioles en forma vitrea. Tambien se proporcionan procedimientos de fabricación y uso del mismo.

Se definen los probioticos como microbios vivos que afectan beneficiosamente al anfitrion modulando la inmunidad mucosa y sisternica, asi como mejorando la función intestinal y el equilibrio microbiano en el tracto intestinal. Se han atribuido diversos efectos nutricionales y terapeuticos a los probioticos, incluyendo: modulaciOn de la respuesta inmunitaria, disminuciOn de las concentraciones de colesterol en el plasma, mejora de los sintomas de intolerancia a la lactose, aumento de la resistencia a enfermedades intestinales infecciosas, disminución de la duración de la diarrea, reducción de la presion sanguinea y contribución a prevenir el cancer de colon (lsolauri E y otros 2001, Kailasapathy K and J. 2000, Marteau PR y otros 2001, Perdigon G y otros 2001) . Para ejercer sus efectos beneficiosos en el anfitrion, los probióticos deben permanecer viables y Ilegar al intestino en grandes numeros (Favaro-Trindade y Grosso 2002) . Sin embargo, mantener la estabilidad a largo plazo de los probióticos requiere condiciones especiales de conservacion, dado que la viabilidad se deteriora rapidamente en un corto periodo de tiempo a temperatura y condiciones de humedad ambiente (Shah 2000) . Adernas del deficiente periodo de validez, ocurre una significative perdida de viabilidad tras la exposición de los probiOticos a las condiciones gastricas de pH

bajo y enzimas digestives. Los procedimientos existentes de conservaciOn no logran proporcionar una viabilidad satisfactoria en la conservacion ni protección gastrica, especialmente si las celulas se almacenan a temperatura y humedad ambiente o mas altas.

A menudo se usa la liofilizacion para la conservacion y el almacenamiento de bacterias debido a la exposición a temperaturas bajas durante el secado. Sin embargo, tiene las caracteristicas poco deseables de reducir

significativamente la viabilidad, asi como requerir mucho tiempo y energia. La liofilizaciOn implica poner las celulas en una soluciOn, congelar la soluciOn y exponer el solidï congelado al vacio en condiciones en las que permanece solidï y el agua y cualquier otro componente volatil son eliminados por sublinnacion. La temperatura estander de liofilizaciOn de -30ïC a -70ïC este por debajo del punto de congelacion del agua, pero este muy por encima de la temperatura de transicion vitrea (Tg) de la solucion de liofilizacion, lo que da como resultado el efecto no deseado de lacristalizacion del agua formando hielo. La congelacion de cultivos bacterianos da como resultado un deo fisico sustancial a la pared celular bacteriana y la consiguiente perdida de viabilidad. Por lo tanto, evitar la formación de hielo durante la frigoconservaciOn de proteinas, virus, celulas, tejidos y organos es un problema importante de la criobiolog la.

Puede disminuirse el punto de congelaciOn del agua anadiendo solutos que reduzcan la presión de vapor del agua.

La depresión del punto de congelacion es la base fisica sobre la que actUan esencialmente todos los anticongelantes usados actualmente (por ejemplo, glicoles, azucares y sales) . La desventaja de los depresores del punto de congelacion, denominados crioprotectores, es que se requieren grandes cantidades de solutos (10% o mas) para reducir el punto de congelacion tan solo algunos grados Celsius. A concentraciones suficientemente

elevadas (normalmente, el 50% o mas) , los anticongelantes convencionales pueden impedir la formación de hielo,

permitiendo que las soluciones acuosas se enfrien hasta temperaturas muy por debajo de 0ïC sin congelarse. Sin embargo, generalmente los crioprotectores son tOxicos en las concentraciones elevadas requeridas para lograr la formación vitrea o vitrificacion.

Otros procedimientos usados para crear preparaciones secas y estables de probiOticos, tales como la desecacion a temperatura ambiente y el secado por pulverizacion, tambien tienen inconvenientes. La desecación a temperatura ambiente o reducida es lenta, requiere precauciones adicionales para evitar una contaminacion y a menudo produce

una viabilidad insatisfactoria. El secado por pulverizacion implica derives cortas hasta temperaturas de tratamiento relativamente elevadas y da como resultado perdidas de viabilidad y tiempos limitados de conservacion, incluso cuando se usan excipientes de estabilizacion (Lievense LC, van 't Riet K. 1994. Convective dr y ing of bacteria. II. Factors influencing survival. Adv Biochem Eng Biotechnol. 51:71-89) .

Simmonds y otros (2005) han descrito una formulaciOn viable y estable para dirigir los probioticos al intestino. El procedimiento requiere la granulacion de bacterias liofilizadas con estabilizadores de celulosa microcristalina, tales

la leche desnatada, sales o azucares de cadena coda, y un desintegrante tal como almidon o acidï alginico. Acto seguido, las bacterias semisecas granuladas son desecadas a 40-70ïC para reducir el nivel de humedad residual a menos del 2 por ciento. Esto es seguido por su recubrimiento con un agente entericï y un plastificante.

Este procedimiento de etapas mUltiples da como resultado un gran tameï de particula (de mas de 425 micr6metros) y sigue dando como resultado una perdida de viabilidad de hasta 1, 5 magnitudes logaritmicas. Una ventaja adicional de este procedimiento es el elevado contenido de los agentes de revestimiento entericï (mas del 25% del peso de la microesfera) , que son sinteticos en su mayoria y no son reconocidos como materiales de calidad

alimentaria. Una desventaja inherente de un procedimiento de revestimiento es que la proporción relative entre el

como

revestimiento y el agente activo se eleva en una función cubica de la particula, cuando el tamafio de particula disminuye, haciendo el procedimiento menos utilizable para la produccion de particulas de tamatios inferiores a 300 micrometros.

Se ha descrito un procedimiento alternativo de conservacion bacteriana que usa una tecnica de formaciOn de

espuma a la vez que elimina la formación de cristales de hielo (Bronshtein y otros 2004, Roser y otros 2004) . Este procedimiento requiere concentraciones elevadas de azucares (una combinación de mono, di y oligosacaridos metilados) en el medio de secado y un liofilizador que esta dotado de un sistema de vacio controlado y de

exposiciOn a la temperatura, y la adicion de elementos formadores de espuma y estabilizantes. A pesar de algunas ventajas de este procedimiento en el logro de la estabilidad de un mayor periodo de validez, las bacterias

conservadas en espuma no estan protegidas del transitï por el est6mago. Ademas, este procedimiento es dificil y costoso de ampliar de escala, porque la espuma requiere, por definicion, grandes volumenes de espacio a presión atmosferica reducida (es decir, en el vacio) para la produccion de una masa muy pequeria. Adernas, este material es

muy sensible a la humedad y el producto absorbe agua facilmente, disminuyendo la viabilidad de las bacterias.

Franks y otros (2003) propusieron una composicion que contenia un azOcar (trehalosa) parcialmente en la fase

vitrea amoría y parcialmente en fase de hidrato cristalino. La fase de hidrato cristalino sirve de agente para deshidratar la fase amoría, mejorando con ello la temperatura de transicion vitrea del estado vitreo amorfo. Se demostrO que esta composiciOn estabilizaba moleculas individuales, como proteinas o nucleotidos. La temperatura de transicion vitrea de una mezcla depende, entre otros factores, de su composición quimica (azOcares, proteinas, sales) y del contenido de humedad, actuando el agua como plastificante, deprimiendo la temperatura de transición

vitrea. Si, en cualquier momento, se supera la temperatura de transicion vitrea (Tg) , ya sea por exposición al calor o

como consecuencia de una migracion de humedad al interior del producto, el estado vitreo amorfo puede Ilegar a ser susceptible de una separacion irreversible de fases por cristalizacion. Entonces, si ocurre la cristalizacion, cualquier fase amoría residual estara compuesta de los demas componentes y la humedad, dando como resultado una depresion adicional de la temperatura de transición vitrea.

Unvidrio es un estado solidï amorfo que se obtiene por desecación controlada de una solucion. La ventaja de la... [Seguir leyendo]

1. Una composicion seca en forma vitrea solida adecuada para su administración oral, comprendiendo la composición una mezcla que incluye al menos un polisacarido, un sacarido, un poliol y bacterias probióticas, en la que el sacarido es trehalosa y la proporción entre el sacarido y el polio! es 3:1 a 1:3.

2. La composición segOn la reivindicacion 1 en la que el poliol se selecciona del grupo constituido por glicerol, manitol, maltitol, isomaltitol, adonitol, lactitol y sorbitol.

3. La composición segun las reivindicaciones 1 o 2 en la que el polisacarido se selecciona de almidOn, de almidOn no digestible, de pectina, inulina, goma xantana, alginato, acidï alginico, quitosano, carragenano, carboximetil celulosa, metil celulosa, goma guar, goma arabiga, goma garrofin y combinaciones de los mismos.

4. La composición segun la reivindicacion 1 en la que las bacterias probióticas se seleccionan del grupo constituido por Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Propionobacterium, BacillusyStreptococcusvivos.

5. La composición segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que la composición es secada al vacio por evaporacion y sin espumado ni formación de hielo, y en la que la composición proporciona protección gastrica de la bacteria probiótica.

Fig. 1

del haft () al secado de Ca' por vacio

- 0"cuerdas" de la matriz "cuerdas"1Z la matriz

de hidrogel hinneda parcialmente desecada

\bandeja de/ \andeja de/ \bandeja dy \cedazo cedazo \cedazo

4419 trehalosa en polvo trehalosaen polvo humedecida seca

reciclar (secado)

Fig. 2

Efecto de la concentracion de trehalosa en el medio de secado sobre la viabilidad de L.rhamnosus

0, 1

0, 0 0 100 200 300 400 500 600

Concentracion de trehalosa (mM)

Fig. 3

Efecto de los sacaridos y los polioles (24% p/v en el medio de secado) sobre la viabilidad de L.paracaseitras el secado al vacio

2, 50E+10

- a.

. 5

E 2, 00E+10

(DC

1, 50E+10 o Antes de t. seco

1, 00E+10 — • Despues de t. seco

E

C 5, 00E+09 —

0

u_

0, 00E+00

Ningun azucar Sorbitol Trehalosa Adonitol Xilitol

Fig. 4

Efecto de la liofilizacion sobre la viabilidad del L. acidophilus en diferentes proporciones de sacaridos/polioles:

1, E+11

1, E+10

1, E+09

—1, E+08

—1, E+07

—1, E+06 Bacterias fibres 3:1 Tre/ Man 3:1 Tre/ leo 2:2 Tre/ Isï 1:3 Tre/ Iso

3. ) N

Fig. 5

Viabilidad de L. acidophilus tras 4 horas a 45 grados C a diferentes porcentajes de humedad relativa:

90 80 70 60 50 40 30 20 10 o I Bacterias libres 3:1 trefiso mezcla de polisacaridos + 3:1 trediso 045C; 33%HR • 45C; 0%HR

Fig. 6

Efecto de diferentes jugos gastricos sobre L.paracaseiseco libre y encapsulado en una mezcla de polisacaridos/sacaridos/polioles

o Control

1, E+12

• JG despues de corner 1, E+11

JG en ayunas 1, E+10 , E+09 1, E+08 1, E+07 1, E+06

N'T

1, E+05 Alginato + 3:1 trefiso Bacterias libres

Fig. 7

Efecto del jugo gastricï estomacal en ayunas sobre L. acidophilus en forma libre seca o encapsulado en una mezcla de alginatos/sacaridos/polioles

1, E+09

—1, E+08 1, E+07 1, E+06

1, E+05 0Ningun JG 1, E+04 •JG

1, E+03 1, E+02 1, E+01 1, E+00 1 1

Bacterias secas libres Alginato + 3:1 tre/iso

• m 4

Fig. 8A

Perdida de L. GGtras cuatro semanas a 40ïC con una humedad del 15%

1, E+10

1, E+09

- -e--Tre/lso --IN--Tre/alb. huevo

1, E+08

1, E+07 0 1 2 3 4 5 Tiempo (semanas)

Fig. 8B

Perdida de L.GGtras cuatro semanas a 40ïC con una humedad del 33%

1, E+10 ,

1, E+09

- -*--Tre/lso

1, E+08

—is— Tre/alb. huevo

—1, E+07

1, E+06 ,

5

o 1 2 34

Tiempo (semanas)