Uso de quelantes inmovilizados para purificación de proteínas recombinantes por cromatografía de iones metálicos inmovilizados y método de purificación de proteínas recombinantes.

Uso de un quelante que tiene 6 o más grupos de coordinación inmovilizados por un solo grupo carboxilo por medio de un enlace carboxamida para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) en la purificación de proteínas recombinantes con una pluralidad de residuos histidina

en donde el quelante inmovilizado es una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en ella que tiene una estructura de fórmula (Ia):

**Fórmula**

en donde SP es una fase sólida;

R1 es hidrógeno o un residuo orgánico que no interfiere con la aplicación de la fase sólida y PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, particularmente de un ácido amino-policarboxílico, o una sal del mismo, y en donde

el quelante está complejado con un ion metálico polivalente, v.g. un ion metálico de transición, tal como un ion Ni2+.

Uso de quelantes inmovilizados para purificación de proteínas recombinantes por cromatografía de iones metálicos inmovilizados y método de purificación de proteínas recombinantes.

La presente invención se refiere al uso de una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en ella y métodos de utilización de la fase sólida, para purificación de polipéptidos recombinantes.

Una estrategia muy potente para purificación de proteínas recombinantes es el uso de un "marcador His", que comprende típicamente 6-1 histidinas consecutivas. Los marcadores His se fijan fuertemente a los sitios de coordinación libres de los iones N¡2+. Los mismos pueden desprenderse por una concentración alta de imidazol, que compite para los sitios de coordinación en N¡2+. Dicho ciclo de absorción y desorción específica puede utilizarse para purificación en un solo paso de una proteína deseada, conduciendo a factores del enriquecimiento de 1 o incluso mayores.

La vahante de esta técnica utilizada más generalmente emplea NaNa-bis(carboximetil)-lisina acopada por el grupo t- amino a cuentas de agarosa. El grupo activo es NTA (ácido nitrilo-triacético) cargado con Ni2+, mientras que el espaciador es un grupo aminobutilo. Dicha matriz Ni2+-NTA presenta, sin embargo, varias desventajas importantes, tales como los elevados costes de la NaNa-bis(carboximet¡l)-l¡s¡na.

Una desventaja adicional es la inestabilidad de los iones N¡2+ inmovilizados. Dado que NTA tiene sólo cuatro sitios de coordinación para N¡2+, los iones N¡2+ se escapan fácilmente de la matriz y contaminan las muestras de proteína. Este es un problema grave por al menos dos razones: N¡2+ es un metal pesado bastante tóxico y cataliza la oxidación indeseable de la muestra de proteína. Adicionalmente, el N¡2+ unido a NTA es reducido fácilmente por agentes protectores de las proteínas tales como DTT (ditiotreitol) y desprendido luego de la matriz. Finalmente, los inhibidores de proteasas quelantes metálicos tales como EGTA o EDTA no pueden combinarse con una matriz Ni2+- NTA, debido a que extraen los iones N¡2+ de esta matriz.

US 25/272116 da a conocer un proceso para purificación de proteínas recombinantes marcadas con histidina que utilizan una composición quelante que comprende un soporte polímero y un precursor de agente quelante unido al mismo por dos enlaces éster o carboxamida. Precursores adecuados de agentes quelantes Incluyen dianhídrido etilenodiaminatetraacético (EDTA) y dianhídrido dietilenotriaminapentaacético (DTPA).

US 6.67.159 describe un método para la preparación de conjugados de quelatos metálicos basados en NTA, en donde NTA o una sal del mismo se hace reaccionar en un medio acuoso a un pH alcalino de al menos 8 con una molécula proteinácea que contiene un grupo amino primario en presencia de carbodiimida.

WO 24/36189 da a conocer un método de separación para polipéptidos que utiliza un soporte modificado con quelato metálico. Este soporte comprende NTA unido a una fase sólida modificada con amino por la vía de un cuerpo carboxamida.

GB 2.67.23 da a conocer agentes quelantes metálicos que comprenden un soporte y unida al mismo una mezcla de amidas de EDTA unidas a su vez por un solo grupo carboxamida o por dos grupos carboxamida. El uso de este soporte para la purificación de polipéptidos no se da a conocer ni se sugiere.

US 24/24569 da a conocer una proteína con marcador His que comprende un marcador (His-Asn)6.

US 22/164718 da a conocer péptidos de afinidad para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) que comprenden un marcador His espaciado con una secuencia de aminoácidos constituida por His, dos aminoácidos alifáticos o amídicos, His, tres aminoácidos básicos o ácidos, His, y un aminoácido alifático o amida.

El objeto conforme a la presente invención fue proporcionar nuevos métodos para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) a fin de soslayar los problemas asociados con la técnica anterior.

Sorprendentemente, se encontró que una fase sólida basada en EDTA complejada con Ni2+, particularmente una fase sólida en la que un grupo carboxilo de EDTA está unido a grupos amino en la fase sólida, tiene propiedades excelentes en aplicaciones de cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC), particularmente para la purificación de polipéptidos recombinantes que comprenden marcadores poli-histidina. Este descubrimiento era totalmente inesperado: conforme a la bibliografía existente, una fase sólida basada en EDTA no debería ser adecuada para cromatografía de quelatos de níquel, dado que este quelante hexadentado debería ocupar la totalidad de las seis coordinaciones en N¡2+, no dejando supuestamente ninguna para la fijación de un residuo histidina. En contraste con esta expectativa, se encontró que una fase sólida basada en EDTA exhibe no sólo una fijación estable de Iones metálicos de transición, particularmente de iones Ni2+, sino que los complejos resultantes con Ni2+, Zn2+, Co2+ o Cu2+ tienen también una selectividad alta para proteínas marcadas con histidina.

Un primer aspecto de la presente Invención se refiere al uso de un quelante inmovilizado que tiene seis o más grupos de coordinación para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC), particularmente para purificación de proteínas marcadas con poli-histidina. El quelante inmovilizado es una amida de ácido policarboxílico

que tiene seis o más grupos de coordinación, que se seleccionan particularmente de grupos amino, carboxilo, carboxamida e hidroxamato.

El quelante inmovilizado es una fase sólida que tiene un ácido policarboxilico inmovilizado a ella con una estructura de fórmula (la):

O

SP nJLPCA (la)

I

R1

en donde SP es una fase sólida;

R1 es hidrógeno o un residuo orgánico que no interfiere con la aplicación de la fase sólida, v.g. un radical alquilo C1-C3, y

PCA es el residuo de un ácido policarboxilico, particularmente de un ácido amino-policarboxilico, o una sal del mismo.

Aún más preferiblemente, la fase sólida tiene una estructura de fórmula (II):

SP-N

H

O

ü

H£ -~COOH

oJ

h2 c -c -n h2 h2

h2

p hdooh "C COOH

h2

(II)

en donde SP es la fase sólida; y

uno o más de los grupos ácido carboxílico puede estar desprotonizado.

El ácido policarboxilico unido a la fase sólida (la), o (II) está complejado con un ion metálico polivalente, v.g. un ion

N¡2+.

En algunas realizaciones de la invención, el grupo carboxamida -NR1-CO- está unido directamente a la fase sólida. En otras realizaciones, el grupo carboxamida está unido a la fase sólida por un enlazador, que puede tener una longitud de 1 átomo hasta 2 átomos, preferiblemente 2-12 átomos, v.g. 2-6 átomos que pueden seleccionarse de átomos de carbono y opcionalmente heteroátomos tales como O y/o N.

Otro aspecto adicional de la presente invención es un método de purificación de un polipéptido recombinante que comprende los pasos: (a) proporcionar una muestra que comprende un polipéptido con una pluralidad de residuos histidina, v.g. una pluralidad de residuos histidina consecutivos, (b) poner en contacto la muestra con una fase sólida como se describe arriba que contiene un ion metálico formador de complejos precombinado, v.g. un ion N¡2+, en condiciones en las cuales el polipéptido recombinante se une selectivamente a la fase sólida, (c) separar el polipéptido recombinante unido de otros componentes de la muestra, y (d) eluir el polipéptido recombinante de la fase sólida.

El ácido policarboxilico tiene 6 o más, v.g., 6, 7 u 8 grupos de coordinación. Preferiblemente, el ácido policarboxilico tiene 4, 5 o más grupos ácido carboxílico. El ácido policarboxilico puede ser un ácido amino-, nitrito- o éter policarboxilico, prefiriéndose tos ácidos amino-policarboxílicos, particularmente ácidos amino-policarboxílicos o grupos amino terciarios. Ejemplos específicos de ácidos policarboxílicos son ácido etileno-diamino-tetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido dietileno-triamino-pentaacético (DTPA) y ácido trietilenotetraamina-N,N,N',N',N",N"-hexaacético (TTHA). Es especialmente preferido EDTA.

El ácido policarboxilico está unido preferiblemente a una fase sólida que comprende grupos amino primarios o secundarios. La unión se lleva a cabo en condiciones que permiten la fijación selectiva de un soto grupo carboxilo del ácido policarboxilico a la fase sólida sin necesidad de aislar una forma activada o derivatizada del ácido policarboxilico tal como... [Seguir leyendo]

1. Uso de un quelante que tiene 6 o más grupos de coordinación inmovilizados por un solo grupo carboxilo por medio de un enlace carboxamida para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) en la purificación de proteínas recombinantes con una pluralidad de residuos histidina

en donde el quelante inmovilizado es una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en ella que tiene una estructura de fórmula (la):

o

SPN-U-PCA (la)

I

R1

en donde SP es una fase sólida;

R1 es hidrógeno o un residuo orgánico que no interfiere con la aplicación de la fase sólida y PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, particularmente de un ácido amino-policarboxílico, o una sal del mismo, y en donde

el quelante está complejado con un ion metálico polivalente, v.g. un ion metálico de transición, tal como un ion Ni2+.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el quelante inmovilizado es una amida de ácido policarboxílico que tiene 6 o más grupos de coordinación, que se seleccionan particularmente de grupos amino, carboxilo, carboxamida e hidroxamato, y en donde el ácido policarboxílico se selecciona particularmente de ácido etileno-diamina- tetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético, (EGTA), ácido dietilentriamino- pentaacético (DTPA), y ácido trietilen-tetraamina-N,N,N',N',N",N"-hexaacético (TTHA), más particularmente de EDTA o sales del mismo.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en donde la fase sólida tiene una estructura de fórmula (II)

Hfi COOH O /

SP -N lJc -N

H

H,

C-C-N H, H,

H2

p-COOH "C-COOH

h2

(H)

en donde SP es la fase sólida, y

en donde uno o más de los grupos ácido carboxílico puede estar desprotonizado.

4. Un método de purificación de un polipéptido recombinante que comprende los pasos:

(a) proporcionar una muestra que comprende un polipéptido con una pluralidad de residuos histidina,

(b) poner en contacto la muestra con una fase sólida que contiene un ácido policarboxílico inmovilizado a ella por un solo grupo carboxilo por medio de un enlace carboxamida que tiene una estructura de fórmula (la):

SP N-^-PCA (la)

R1

en donde SP es la fase sólida;

R1 es hidrógeno o un residuo orgánico que no interfiere con la aplicación de la fase sólida, y

PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, particularmente de un ácido amino-policarboxílico, o una sal

del mismo, y más preferiblemente el residuo de EDTA o una sal del mismo.

en donde la amida o éster del ácido policarboxílico inmovilizado tiene al menos 6 o más grupos de coordinación, que se seleccionan particularmente de grupos amino, carboxilo, carboxamida e hidroxamato; en donde dicha fase sólida contiene un ion metálico complejante pre-combinado, v.g. un ion Ni2+, en condiciones en las cuales el polipéptido recombinante está fijado selectivamente en la fase sólida,

(c) separar el polipéptido recombinante fijado de los otros componentes de la muestra, y

(d) eluir el polipéptido recombinante de la fase sólida.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el polipéptido comprende al menos 6 residuos histidina consecutivos, o en donde el polipéptido comprende al menos 4 residuos histidina en una secuencia [HnSm]k, en donde H es un residuo histidina y S es un residuo espaciador, seleccionado de glicina y/o serina y/o treonina, n es 5 en cada caso independientemente 1-4, m es en cada caso independientemente 1-6 y k es 2-6.