Uso de las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4 para la detección de Escherichia coli y procedimiento de detección.

Uso de una mezcla de las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4 (y procedimiento de obtención de dichas proteínas) para la detección de Escherichia coli en un líquido,

por ejemplo: aguas de consumo, bebidas embotelladas, homogeneizado procedente de un alimento, aguas residuales destinadas a consumo agrícola y líquidos de la industria láctea y conservera. La invención también se refiere a un procedimiento de detección de Escherichia coli en un líquido que comprende: filtrar dicho líquido a través de un filtro, añadir las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4 sobre dicho filtro, detectar la señal de fluorescencia emitida por las moléculas fluorescentes presentes en el filtro y cuantificar el número de células de E. coli presentes en dicho líquido a partir del valor de fluorescencia detectado en la etapa anterior.

Uso de las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4 para la detección de Escherichia coli y procedimiento de detección

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la detección de contaminación microbiológica en tiempo real. En la presente invención, se detecta Escherichia coli utilizando proteínas con afinidad específica para componentes de la pared celular y/o membrana celular de E. coli. Estas proteínas son Hadrurina (procedente del alacrán Hadrurus aztecus) , Colicina S4 (bacteriocina procedente de E. coli) y proteína de cápside gp12 (procedente del fago T4) , unidas a la proteína verde fluorescente GFP.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el estado de la técnica se han utilizado con anterioridad diversos métodos para detectar la presencia de Escherichia coli. Podemos citar entre otros la hibridación de ADN, PCR o qRT-PCR, inmunoensayos, separación inmunomagnética, separación inmune por flujo lateral y detección por nanopartículas.

Los métodos previos del estado de la técnica presentan ciertos inconvenientes. Así, por ejemplo, los métodos basados en el uso de anticuerpos necesitan mantener las soluciones de anticuerpos refrigerados y en unas condiciones óptimas de conservación y conllevan normalmente múltiples pasos de lavado. Otros métodos requieren muchas copias de la molécula diana para dar una señal medible por lo que es necesario amplificar esta señal.

La presente invención propone un sistema alternativo de detección de E. coli, que permite detectar la presencia de unas pocas células de E. coli en una muestra de agua, sin necesidad de amplificación de la señal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Una realización de la invención es el uso, en adelante uso de la invención, de una mezcla de las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4, identificadas por las secuencias SEQ ID NO: 3, 6 y 9 respectivamente, para la detección de Escherichia coli en un líquido.

La Hadrurina es un péptido antimicrobiano de 41 aminoácidos de longitud, que forma parte del cóctel químico presente en el veneno del alacrán centroamericano Hadrurus aztecus, y que es capaz de unirse a la membrana externa de E. coli.

La estructura tridimensional de este péptido es una hélice alfa corta, que físicamente se intercala entre los constituyentes de esta membrana externa, produciendo poros en la misma que desorganizan las envueltas celulares y posteriormente causan la lisis de la célula bacteriana.

La unión del fago T4 a E. coli se realiza mediante las espículas o fibras cortas de la cola denominadas gp12. Los receptores de gp12 son los lipopolisacáridos y las proteínas OmpC de E. coli.

La Colicina-S4 es un tipo de bacteriocina específica para E.coli. Las bacteriocinas son sustancias de naturaleza proteica que actúan como bactericidas y son sintetizadas por algunas cepas bacterianas. El mecanismo de acción es diverso (bloqueos metabólicos, cambios de permeabilidad en la membrana celular, daño o degradación de DNA, etc.) . La Colicina-S4 forma poros en la membrana citoplasmática, rompiéndola por gradiente electroquímico. Los receptores de esta bacteriocina son OmpW, F y Tol System.

Las tres proteínas quiméricas comprenden un dominio catalítico y un péptido de unión específico para una proteína diana situada en la pared de E. coli.

En la presente invención se entiende por “quimeras” o “proteínas quiméricas” a proteínas que comprenden secuencias procedentes de diferentes organismos, y que han sido por tanto diseñadas, sintetizadas y aisladas por los inventores.

Las tres quimeras son GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina S4. El uso de las tres quimeras consigue una mayor unión a la pared de E.coli y una mayor emisión de fluorescencia.

Las tres proteínas quiméricas comprenden:

-Dominio catalítico: GFP

- Espaciador: Secuencia de 101 aminoácidos

- Péptido de unión específica a E. coli: Hadrurina, gp12 o Colicina S4

Adicionalmente, dichas proteínas quiméricas contienen también una cola de histidinas, útil para purificar en columnas cromatográficas de Ni-sefarosa.

Como dominio catalítico se ha utilizado GFP (Proteína Verde Fluorescente) . El gen de la GFP ha sido aislado de la medusa Aequorea victoria y genera una proteína de 238 aminoácidos que adopta una conformación tridimensional de barril, capaz de emitir luz fluorescente (rango de absorción-emisión: 395nm-508nm) una vez excitada con un haz de luz ultravioleta. Su detección se realiza por medio de un equipo capaz de medir fluorescencia.

Una realización es el uso de la invención, donde dicho líquido se selecciona del grupo compuesto por aguas de consumo, bebidas embotelladas, homogeneizado procedente de un alimento, aguas residuales destinadas a consumo agrícola, líquidos de la industria láctea y líquidos de la industria conservera.

Una realización de la invención es un procedimiento de detección de Escherichia coli en un líquido, en adelante procedimiento de detección de la invención, que comprende las siguientes etapas:

(a) filtrar dicho líquido a través de un filtro,

(b) añadir las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4, identificadas por las secuencias SEQ ID NO: 3, 6 y 9 respectivamente, sobre dicho filtro,

(c) detectar la señal de fluorescencia emitida por las moléculas fluorescentes presentes en el filtro y

(d) cuantificar el número de células de E. coli presentes en dicho líquido a partir del valor de fluorescencia

detectado en la etapa anterior. La filtración de la etapa (a) se puede realizar utilizando un filtro de tamaño de poro 0, 45 micras donde quedan retenidos todos los microrganismos.

Después de la etapa (b) se puede realizar un lavado para que difundan las proteínas que no se hayan unido a la

pared de E.coli. El procedimiento de detección de la invención garantiza la posibilidad de detectar la presencia de una única célula bacteriana de E. coli. Este procedimiento permite determinar si la muestra testada cumple con las exigencias sanitarias recogidas en la legislación vigente en tiempo real.

Una realización es el procedimiento de detección de la invención, donde dicho líquido se selecciona del grupo compuesto por aguas de consumo, bebidas embotelladas, homogeneizado procedente de un alimento, aguas residuales destinadas a consumo agrícola, líquidos de la industria láctea y líquidos de la industria conservera.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS A continuación se aporta una traducción al español del texto libre que aparece en la lista de secuencias. SEQ ID NO: 1. Quimera GFP-Hadrurina SEQ ID NO: 2. Quimera GFP-Hadrurina con cola de His 1..7 Cola de His; 8..244 Proteína GFP; 245..344 Espaciador; 345..386 Hadrurina SEQ ID NO: 3. Quimera GFP-Hadrurina sin cola de His 1..236 proteína GFP; 237..336 Espaciador; 337..379 Hadrurina SEQ ID NO: 4. Quimera GFP-gp12 SEQ ID NO: 5. Quimera GFP-gp12 con cola de His 1..7 Cola de His; 8..244 Proteína GFP; 245..344 Espaciador; 345..386 Proteína del fago T4 gp12 SEQ ID NO: 6. Quimera GFP-gp12 sin cola de His 1..236 Proteína GFP; 237..336 Espaciador; 337..977 Proteína del fago T4 gp12 SEQ ID NO: 7. Quimera GFP-colicina-S4 SEQ ID NO: 8. Quimera GFP-colicina-S4 con cola de His 1..7 Cola de His; 8..244 Proteína GFP; 245..344 Espaciador; 345..843 Proteína del fago T4 gp12 SEQ ID NO: 9. Quimera GFP-colicina-S4 sin cola de His

1..236 Proteína GFP; 237..336 Espaciador; 337..836 Proteína del fago T4 gp12

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. La figura muestra el diagrama de bloques del sistema de medida utilizado para la detección de E.coli. Una fuente de luz (1) , constituida por dos LED UV de 308 nm, que excitan la proteína fluorescente que recubre cada célula de E.coli, retenida en el filtro de papel (2) . La fluorescencia emitida por la proteína es recogida por un módulo fotosensor de tipo PMT (3) , previamente filtrada por el filtro óptico paso-banda centrado en 508 nm (4) . Todo ello va situado sobre un tubo de PVC (5) . El resto de bloques son la fuente de alimentación (6) , el circuito de medida (7) y el circuito de control (8) . La elección del filtro óptico y del número de LEDs de excitación se escogió en base a la cantidad de luz reflejada por el filtro de papel y las dimensiones del tubo de PVC.

Figura 2. Esquema de la estructura del plásmido pNCF68. “GFP-gp12” en esta figura corresponde a la SEQ ID NO: 4.

Figura 3. Esquema de la estructura del plásmido pNCF69. “GFPHD” en esta figura corresponde a la SEQ ID NO:

1.

Figura 4. Esquema...

1. Uso de una mezcla de las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4, identificadas por las secuencias SEQ ID NO: 3, 6 y 9 respectivamente, para la detección de Escherichia coli en un líquido.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho líquido se selecciona del grupo compuesto por aguas de consumo, bebidas embotelladas, homogeneizado procedente de un alimento, aguas residuales destinadas a consumo agrícola, líquidos de la industria láctea y líquidos de la industria conservera.

3. Un procedimiento de detección de Escherichia coli en un líquido, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

(a) filtrar dicho líquido a través de un filtro,

(b) añadir las proteínas GFP-Hadrurina, GFP-gp12 y GFP-Colicina-S4, identificadas por las secuencias SEQ ID NO: 3, 6 y 9 respectivamente, sobre dicho filtro,

(c) detectar la señal de fluorescencia emitida por las moléculas fluorescentes presentes en el filtro y

(d) cuantificar el número de células de E. coli presentes en dicho líquido a partir del valor de fluorescencia 15 detectado en la etapa anterior.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que dicho líquido se selecciona del grupo compuesto por aguas de consumo, bebidas embotelladas, homogeneizado procedente de un alimento, aguas residuales destinadas a consumo agrícola, líquidos de la industria láctea y líquidos de la industria conservera.

LISTA DE SECUENCIAS