Una bolsa que comprende

(a) una primera lámina de película polímera;

(b) una segunda lámina de película polímera; en donde dicha segunda lámina se superpone sobre dicha primera lámina; y en donde dicha primera lámina y dicha segunda lámina se sellan entre sí directamente, o indirectamente a través de una película polímera intercalada, definiendo de este modo un perímetro sellado que forma una bolsa;

(c) un lugar de contención dentro de la bolsa, comprendiendo dicho lugar un concentrado de nutrientes; y

(d) opcionalmente uno o varios lugares de contención adicionales dentro de la bolsa, comprendiendo cada uno de los lugares adicionales un aditivo seleccionado entre el grupo consistente en compuesto indicador, colorante, atenuador, fijador, reactivo para la extracción o la detección de microorganismos, y combinaciones de dos o varios de los mismos; en donde el reactivo para la extracción o la detección de microorganismos es puro o comprende uno o varios aditivos adicionales, diluyentes, fagos, componentes derivados de fagos, anticuerpos, polihistaminas, dominios de unión a maltosa, péptidos de afinidad, aptómeros, biotinas, estreptavidinas, u otras moléculas de afinidad;

en donde dicho lugar de contención, si está presente, o al menos uno de dichos lugares de contención adicionales, comprende (1) al menos una junta frágil interna al perímetro, que divide dicha bolsa en compartimentos separados, o (2) una bolsita; en donde dicha junta frágil o dicha bolsita está formada ella misma al menos parcialmente por un material polímero que reacciona con el agua; y en donde dicho material polímero que reacciona con el agua se disuelve, se rompe, se dispersa y/o se descompone después de entrar en contacto con agua.

Bolsa flexible para medio de cultivo que contiene un concentrado de nutrientes

Esta invención se refiere a una bolsa para medio de cultivo que comprende un compartimento principal y un lugar de contención que contiene un concentrado de nutrientes hasta que se libera en el momento de uso.

Antecedentes de la invención

Los microorganismos pueden existir en los alimentos y en el medio ambiente en concentraciones tan bajas que son diffciles de medir, pero siguen representando un riesgo significativo para la salud. Los microbi6logos incuban muestras en medios de cultivo lfquidos para detectar y realizar pruebas para microorganismos patógenos, tales como los incluidos en el genero Salmonella, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Campylobacter y Escherichia coli.

Pruebas de tipos similares se llevan a cabo para detectar la presencia de microorganismos en muestras que normalmente se espera que sean esteriles, tales como sangre, lfquido cefalorraquídeo, dispositivos medicos y una amplia variedad de materiales industriales.

Con el fin de aumentar la concentración de los microorganismos a niveles medibles, una muestra para analisis se mezcla con un medio nutriente que permite el crecimiento de la población del organismo. Este crecimiento se puede

realizar en dos etapas: (1) la homogeneización del nutriente y la muestra de modo que se mezclen a fondo, y (2) un perfodo mas largo cuando la muestra y el nutriente se exponen a temperaturas que favorecen el crecimiento del organismo diana. Durante esta segunda etapa, se pueden introducir aditivos adicionales en el medio nutriente para crear un entorno de crecimiento desfavorable para los organismos no diana. Estas dos etapas se denominan "enriquecimiento de la muestra" en la industria alimentaria.

El documento de Patente de EE.UU. 6.312.930 describe un metodo para la detección de bacterias diana específicas en una mezcla de muestras compleja, tal como una muestra de alimentos, mediante el cultivo de la muestra seguido del aislamiento y la detección del ADN de las bacterias diana. El ADN diana se amplifica a traves de protocolos de amplificación por PCR y la detección se realiza mediante electroforesis en gel o por medios fluorescentes.

Tradicionalmente, el enriquecimiento de la muestra se habfa llevado a cabo en recipientes cerrados rígidos, tales

como botellas, pero un enfoque que se prefiere ahora es realizar el enriquecimiento en bolsas de plastico flexibles, a las cuales se hace referencia frecuentemente como "bolsas para homogeneizador" o "bolsas Stomacher®". Estas bolsas ofrecen ventajas sobre los recipientes de paredes sólidas porque una maquina puede manipular mecanicamente la bolsa y su contenido, realizando de este modo la homogenización de la muestra. Un homogeneizador típico tiene paletas de movimiento alternativo que pulverizan y mezclan la muestra con el medio del

cultivo.

En la practica, un microbi6logo o un tecnico en un laboratorio de ensayos, prepara una serie de medios de enriquecimiento diferentes, tales como soluciones de cultivo líquidas y esteriles, y soluciones de diluyentes tamponadas con composiciones diferentes para distintos microorganismos diana. Los medios de preparación y de esterilización son bien conocidos para un experto en la tecnica. Lotes grandes de los medios y de los aditivos se

pueden preparar, y porciones mas pequenas se transfieren a las bolsas para homogeneizador, para analisis individuales. La preparación de los medios de cultivo en cada laboratorio de ensayos es una labor costosa e intensa, y sujeta a error, especialmente durante las operaciones de medición y de transferencia. Este procedimiento de preparación de medios, esterilización, almacenamiento e introducción en las bolsas para homogeneizador, se considera gravoso para la industria de ensayos alimentarios y ambientales.

Por lo tanto, se han producido unos recipientes rígidos cargados previamente y esterilizados. Esto permite que el laboratorio se limite a la tarea de introducir las muestras de la prueba en los recipientes despues de su llegada. Vease, por ejemplo, el documento de Patente de EE.UU. 6.379.949.

Sin embargo, el envfo de soluciones de cultivo líquidas, incluso en bolsas flexibles, puede no ser recomendable debido al peso y al volumen de las soluciones. Ademas, una amplia variedad de analisis necesarios en la industria 45 de ensayos alimenticios y ambientales, pueden requerir muchos medios de cultivo diferentes en terminos de dilución, volumen, perfil de nutrientes y/u otros factores. La amplia variedad de medios de cultivo puede resultar en un inventario excesivamente complejo de bolsas llenadas previamente para la fabricación y distribución. Por lo tanto, puede ser deseable proporcionar bolsas para homogeneizador con concentrados de nutrientes medidos, a los que se puede anadir agua purificada en el momento de uso en el laboratorio de ensayo. Alternativamente, puede ser 50 deseable proporcionar bolsas para homogeneizador llenadas previamente, en donde el concentrado de nutrientes y el agua estan contenidos en compartimentos separados hasta el momento del uso de la bolsa. Ademas, el proporcionar bolsas en las que los nutrientes estan contenidos en un envase esteril y no en un "caldo" hasta el momento del uso, minimiza las posibilidades de crecimiento de microorganismos que entren en la bolsa casualmente, antes de su uso previsto. Ademas, en algunos casos puede no ser deseable almacenar juntos

55 diversos componentes nutrientes en solución, requiriendo que se mezclen en el momento del uso. Para aquellos casos en los que los componentes del medio nutriente no son compatibles entre sí durante largos perfodos de tiempo, son deseables compartimentos multiples, conteniendo cada uno un componente del medio nutriente final.

Las bolsas flexibles con juntas fragiles se han descrito, por ejemplo, en los documentes de Patente de EE.UU. 4.602.910, Patente de EE.UU. 5.728.542, la solicitud de Patente de EE.UU. 2004/118710 y la solicitud de Patente PCT W091/07503.

Resumen de la invención

La invención incluye una bolsa que comprende

(a) una primera lamina de pelfcula polímera;

(b) una segunda lamina de pelfcula polímera; en donde al menos dicha segunda lamina se superpone sobre dicha primera lamina; y en donde dicha primera lamina y dicha segunda lamina estan selladas entre sí directamente, o indirectamente a traves de una pelfcula polímera intercalada, definiendo de este modo un perfmetro sellado que forma una bolsa;

(c) un lugar de contención dentro de la bolsa, comprendiendo dicho lugar un concentrado de nutrientes; y

(d) opcionalmente uno o varios lugares de contención adicionales dentro de la bolsa, comprendiendo cada uno de los lugares adicionales un aditivo seleccionado entre el grupo consistente en compuesto indicador, colorante, atenuador, fijador, reactivo para la extracción o la detección de microorganismos y combinaciones de dos o varios de los mismos; en donde el reactivo para la extracción o la detección de microorganismos es puro o comprende uno o varios aditivos adicionales, diluyentes, fagos, componentes derivados de fagos, anticuerpos, polihistaminas, dominios de unión a maltosa, peptidos de afinidad, apt6meros, biotinas, estreptavidinas, u otras moleculas de afinidad;

en donde dicho lugar de contención o, si esta presente, al menos uno de dichos lugares de contención adicionales, comprende (1) al menos una junta fragil en el interior del perfmetro, que divide dicha bolsa en compartimentos separados, o (2) una bolsita; en donde dicha junta fragil o dicha bolsita esta formada ella misma al menos parcialmente por un material polímero que reacciona con el agua; y en donde dicho material polímero que reacciona con el agua se disuelve, se rompe, se dispersa y/o se descompone despues de entrar en contacto con agua.

Esta invención tambien incluye un procedimiento que se puede utilizar para determinar la presencia de una bacteria diana específica, sospechosa de estar en una muestra, utilizando un recipiente tal y como se ha descrito anteriormente. El procedimiento comprende

insertar una muestra que contiene el microorganismo en una bolsa tal y como se ha caracterizado anteriormente;

liberar un concentrado de nutrientes desde el lugar de contención para producir un medio de cultivo;

incubar... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIoNES

1. Una bolsa que comprende

(a) una primera lamina de pelfcula polímera;

(b) una segunda lamina de pelfcula polímera; en donde dicha segunda lamina se superpone sobre dicha

primera lamina; y en donde dicha primera lamina y dicha segunda lamina se sellan entre sí directamente, o indirectamente a traves de una pelfcula polímera intercalada, definiendo de este modo un perfmetro sellado que forma una bolsa;

(c) un lugar de contención dentro de la bolsa, comprendiendo dicho lugar un concentrado de nutrientes; y

(d) opcionalmente uno o varios lugares de contención adicionales dentro de la bolsa, comprendiendo cada uno

de los lugares adicionales un aditivo seleccionado entre el grupo consistente en compuesto indicador, colorante, atenuador, fijador, reactivo para la extracción o la detección de microorganismos, y combinaciones de dos o varios de los mismos; en donde el reactivo para la extracción o la detección de microorganismos es puro o comprende uno o varios aditivos adicionales, diluyentes, fagos, componentes derivados de fagos, anticuerpos, polihistaminas, dominios de unión a maltosa, peptidos de afinidad, apt6meros, biotinas, estreptavidinas, u otras

moleculas de afinidad;

en donde dicho lugar de contención, si esta presente, o al menos uno de dichos lugares de contención adicionales, comprende (1) al menos una junta fragil interna al perfmetro, que divide dicha bolsa en compartimentos separados, o

(2) una bolsita; en donde dicha junta fragil o dicha bolsita esta formada ella misma al menos parcialmente por un

material polímero que reacciona con el agua; y en donde dicho material polímero que reacciona con el agua se 20 disuelve, se rompe, se dispersa y/o se descompone despues de entrar en contacto con agua.

2. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la bolsa incluye un cierre reutilizable.

3. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el lugar comprende un polvo, granulo, bolita, lamina o placa que comprende una matriz de material polímero que reacciona con el agua en donde se mezcla el concentrado de nutrientes.

25 4. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 3, en donde al medio nutriente se da forma de bolita, lamina o placa antes de la aplicación del recubrimiento de material polímero que reacciona con el agua.

5. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en donde el lugar o uno de los lugares adicionales comprenden un comprimido o una capsula capaz de ser pulverizado y/o disuelto durante un proceso de homogeneización.

30 6. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5, que comprende el lugar o varios lugares de contención adicionales en donde el lugar o los lugares adicionales comprenden un antibiótico y el reactivo esta en forma de lfquido, gel, pasta, polvo seco, granulado u otra forma que es capaz de fluir libremente.

7. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el reactivo se inmoviliza sobre un soporte sólido que comprende partfculas magneticas o partfculas paramagneticas.

35 8. La bolsa de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, que comprende (1) unos medios de gufa para facilitar la apertura de la bolsa para anadir una muestra de cultivo en donde los medios de gufa comprenden al menos una muesca, una perforación o una combinación de las mismas incorporada en la bolsa, próxima al sellado superior o (2) una base reforzada que permite que la bolsa se mantenga en posición vertical cuando se llena.

9. Un procedimiento que comprende

insertar una muestra que contiene un microorganismo en una bolsa segun se ha caracterizado en las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8;

liberar un concentrado de nutrientes desde el lugar para producir un medio de cultivo;

incubar la muestra en el medio de cultivo para formar una mezcla de la muestra enriquecida y compleja; y

detectar el microorganismo en la mezcla de la muestra.

45 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la detección comprende obtener el ADN total a partir del microorganismo; poner en contacto el ADN total con una composición de replicación de ensayo para formar una primera mezcla de reacción y con una composición de replicación de testigo positivo para formar una segunda mezcla de reacción; termociclar la primera mezcla de reacción y la segunda mezcla de reacción produciendo de este modo un producto de amplificación del ADN; y detectar el producto de la amplificación en

50 donde la composición de replicación de ensayo puede comprender una polimerasa, una pareja de cebadores y un

reactivo; la composición de replicación de testigo positivo comprende una polimerasa, al menos un fragmento de acido nucleico testigo, un cebador unico capaz de hibridarse con una porción del fragmento de acido nucleico testigo, y el reactivo; el reactivo es necesario para efectuar la amplificación del ADN; y el microorganismo incluye el genero Campylobacter, Listeria, Escherichia, Staphylococcus o Clostridium.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde la mezcla de la muestra compleja comprende una matriz alimentaria enriquecida no selectivamente; la composición de replicación de ensayo o la composición de replicación de testigo positivo se encuentra preferiblemente en forma de comprimido o comprende un agente intercalante; la presencia de los productos de la amplificación se detecta por medios fluorescentes; y el agente intercalante es preferiblemente un colorante de cianina asimetrica que incluye quinolinio, tetrayoduro de 1, 1'

[1, 3-propanoediilbis[ (dimetiliminio) -3, 1-propanodiil]]bis[4-[ (3-metil-2 (3H) -benzotiazoIiliden) metilo]], o quinolinio, diyoduro de 4-