TET2 como nuevo marcador de diagnóstico y de pronóstico en neoplasias hematopoyéticas.

Método in vitro para diagnosticar un tumor mieloide o un tumor linfoide en un sujeto,

que comprende la etapa de analizar una muestra biológica de dicho sujeto:

(i) detectando la presencia de una mutación en el gen del miembro 2 de la familia de proteínas Ten Eleven Translocation (TET2) que codifica el polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº:2, en el que dicha mutación se selecciona de entre el grupo que consiste en supresiones, inserciones y mutaciones de punto, tales como mutaciones que afectan a sitios de corte y empalme, mutación de aminoácido y mutaciones finalizadoras, y/o

(ii) analizando la expresión del gen TET2;

en el que la detección de tal mutación de TET2, de la ausencia de expresión de TET2, o de la expresión de una TET2 truncada es indicativa de un sujeto que desarrolla o está predispuesto a desarrollar un tumor mieloide o un tumor linfoide.

TET2 como nuevo marcador de diagnóstico y de pronóstico en neoplasias hematopoyéticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a marcadores genéticos para diagnosticar neoplasias mieloides, más particularmente a un nuevo gen supresor de tumores recientemente identificado, el gen del miembro 2 de la familia de proteínas Ten Eleven Translocation (TET2). Las alteraciones genéticas de TET2 son útiles para diagnosticar tumores mieloides, tales como síndromes mielodisplásicos/mieloproliferativos, MDS, AML o MPD, y tumores linfoides.

Antecedentes de la invención

La hematopoyesis se mantiene mediante un sistema jerárquico en el que las células madre hematopoyéticas (HSC) dan lugar a progenitores multipotentes, que a su vez se diferencian en todos los tipos de células sanguíneas maduras. Se han estudiado ampliamente los mecanismos moleculares que controlan la multipotencialidad, autorrenovación, la quiescencia e internalización de las HSC. Sin embargo, permanecen por abordar numerosos aspectos, y siguen sin identificarse genes importantes que regulan estos procesos.

Las neoplasias mieloides incluyen leucemia mieloide aguda (AML), trastornos mieloproliferativos (MPD), síndromes mielodisplásicos (MDS) y síndromes mielodisplásicos/mieloproliferativos que son todos ellos trastornos malignos clónales de células madre (HSC) o progenitoras (TIU et al., Leukemia, vol. 21(8), p: 1648-57, 27).

Varias mutaciones genéticas se han correlacionados con AML, y se reconocen cuatro grupos: (i) la AML con anormalidades genéticas recurrentes AML t(8;21)(q22;q22) con gen de fusión RUNX1-ETO; AML con eosinófilos de médula ósea anormales e inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q22) con reorganización CBFB/MYH11; leucemia promielocítica aguda APL con t(15;17)(q22;q12) PML/RARA; AML con anormalidades 11q23 (MLL)); (ii) AML con displasia multilinaje tras MDS o MDS/MPD o sin antecedente de MDS o MPD; (iii) terapia de AML o de MDS relacionada; y (iv) otra AML sin clasificar entre las cuales está el grupo de AML con cariotipo normal cuyo pronóstico se basa en el análisis molecular de oncogenes tales como mutaciones de FLT3-ITD o NPM1.

Los síndromes mielodisplásicos/mieloproliferativos incluyen cuatro enfermedades mieloides agrupadas en 1999 por la OMS: leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielomonocítica juvenil (JMML), leucemia mieloide crónica atípica (aCML) y síndromes mielodisplásicos/mieloproliferativos sin clasificar (U-MDS/MPS). HAASE et al., Annals of Hematology, vol. 87, n° 7, abril de 28, es un repaso en el campo técnico de síndromes mielodisplásicos/mieloproliferativos.

Los MDS incluyen anemia refractaria (RA), y citopenia refractaria con displasia multilinaje (RCMD). Los MDS se caracterizan por hematopoyesis ineficaz en uno o más de los linajes de la médula ósea. El MDS temprano demuestra mayoritariamente apoptosis excesiva y displasia de células hematopoyéticas (CLAESSENS et al., Blood, vol. 99, p: 1594-61, 22; CLASESSENS et al., Blood, vol. 15, p: 435-42, 25). En alrededor de un tercio de los pacientes con MDS, esta hematopoyesis ineficaz precede la progresión a AML secundaria (sAML). Aunque se han identificado algunos sucesos moleculares asociados con subtipos de MDS específicos (ELBERT et al., Nature, vol. 451(7176), p: 335-9, 28) o con transformación de la enfermedad (BRAUN et al., Blood, vol. 17(3), p: 1156-65, 26), todavía se comprenden pobremente los defectos moleculares subyacentes. No existen actualmente marcadores biológicos, excepto rasgos morfológicos, para el diagnóstico y pronóstico tempranos.

Los MPD, denominados actualmente como neoplasias mieloproliferativas (MPN; TEFFERI y VARDIMAN, Leukemia, vol. 22, p: 14-22, 28), son enfermedades mieloides crónicas que incluyen leucemia mielogenosa crónica (CML), policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET), mielofibrosis primaria (PMF) y mielofibrosis idiopática (IMF). Los MPD se caracterizan por una mayor proliferación de uno o varios linajes mieloides. Si la mayoría de los MPD son enfermedades esporádicas, se han dado a conocer (GILBERT, Baillieres Clin. Haematol., vol. 11, p: 849-858, 1998; KRALOVICS et al., Blood, vol. 12, p: 3793-3796, 23; BELLANNE-CHANTELOT et al., Blood, vol. 18, p: 346- 352, 26) casos familiares de MPD, para los cuales se desconoce la prevalencia exacta. El análisis clínico de estos casos familiares ha demostrado que son fenotípicamente idénticos a los casos esporádicos. No obstante, las familias de MPD se caracterizan por una heterogeneidad clínica y genética. En primer lugar, los casos de MPD de una única familia pueden presentar el mismo subtipo o tipos diferentes de MPD (GILBERT, mencionado anteriormente, 1998; BELLANNE-CHANTELOT et al., mencionado anteriormente, 26; RUMI et al., Cáncer, vol. 17, p: 226-2211, 26). En segundo lugar, alrededor de 6-15% de pacientes con PV y 3-5% de pacientes con ET están en riesgo de desarrollar complicación hematológica después de 15 años de evolución (FINAZZI y HARRISON, Semin. Hematol., vol. 42, p: 23-238, 25; KILADJIAN et al., Blood, vol. 112, p: 1746, 28; PASSAMONTI et al., Blood, vol. 111, p: 3383-3387, 28; PASSAMONTI et al., Haematologica, vol. 93, p: 1645-1651,28).

Los MPD, tanto en casos esporádicos como familiares, están habitualmente asociados con una actividad de cinasa constitutiva adquirida, como se ejemplifica por la mutación JAK2V617F en policitemia vera, en la mayoría de los casos

de PV y en la mitad de los casos de ET y PMF (MORGAN y GILLIGAND, Annu. Rev. Med.,, vol. 59, p: 213-22, 28; DELHOMMEAU et al., Cell Mol. Ufe Sel., vol. 63(24), p: 2939-53, 26, CAMPBELL y GREEN, N. Engl. J. Med., vol. 355(23), p: 2452-66, 26; BELLANNE-CHANTELOT et al., mencionado anteriormente, 26; JAMES et al., Nature, vol. 434, p: 1144-1148, 25; BAXTER et al., Lancet, vol. 365, p: 154-161, 25; LEVINE et al., Blood, vol. 16, p: 3377-3379, 25; KRALOVICS et al., N. Engl. J. Med., vol. 352, p: 1779-179, 25). Los MPD resultan frecuentemente de la expresión de una proteína tlroslna clnasa constitutiva:

- A través de una fusión como BCR-ABL en CML, FIP1L1-PDGFRA en HES, TEL-PDGFRB en CMML con hipereosinofilia, ZNF198-FGFR1 en MPD raro acoplado a proliferación linfoide, y PCM1-JAK2 en MPDs raros, AML y linfomas de llnfocltos T

- Una mutación nucleotídlca limitada o Individual, es decir, JAK2 V617F (1849G>T), cuyo reciente descubrimiento en PV (98%), ET (75%), IMF (5%) y un pequeño porcentaje de CMML, MDS/MPD y U-MPD permite una nueva clasificación de MPD y criterios de diagnóstico y perspectivas para el tratamiento. Además, las mutaciones KIT son recurrentes en la proliferación de mastocitos slstémlca.

- A través de mutaciones activantes en el receptor del receptor de trombopoyetina (MPL), especialmente del triptófano 515 (MPLWSIS^) (PIKMAN et al., PLoS Med, vol. 3(e27), 26; CHALIGNÉ et al., Leukemia, vol. 22, p. 1557-66, 28).

- Casos marginales de CML que se presentan con reorganización BCR/JAK2 debido a t(9;22)(p24;q11).

El gen JAK2 en el cromosoma 9p codifica una tlroslna clnasa que se asocia con receptores de atocinas tipo 1. Se predice que la mutación V617F interrumpe el efecto autolnhibidor del dominio JH2 a la activación constitutiva de la clnasa. JAK2 de tipo salvaje ejerce un efecto negativo dominante sobre la actividad de la proteína mutada. Por lo tanto, la pérdida de JAK2 de WT asociada con la duplicación del gen mutado por recombinación mitótlca observada en la mayoría de las muestras de MPD permite una mayor expresión y actividad de la cinasa mutada.

Sin embargo, varias observaciones, tales como la policitemia vera que coexpresa el JAK2 de WT y mutado y la caracterización de AML secundaria que surge de MPD mutado pero que carece de la mutación JAK2 en las fases de erupción, indican sucesos oncogenéticos que ocurren tempranamente antes de la mutación JAK2. Además, y como se discute previamente, la evolución de la enfermedad de MPD es de hecho muy variable en y entre familias. De este modo, existen ciertas pruebas de que existe al menos alguna otra mutación distinta de JAK2 implicada en MPD y, más específicamente, su progresión.

Los tumores linfoides consisten en la expansión de células con rasgos linfoides. La leucemia/linfoma linfoblástica aguda son proliferación de células bloqueadas en la diferenciación linfoide, ya sea de origen T (leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T; T-ALL) o B (leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B; BCP-ALL). Algunas leucemias y linfomas son de origen asesinas naturales (NK). Los linfomas implican la expansión de células linfoides más maduras (B o T), algunas neoplasias son crónicas, y pueden implicar linfocitos T (leucemia prolinfocítica) o células B (leucemia linfocítica crónica).... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para diagnosticar un tumor mieloide o un tumor linfoide en un sujeto, que comprende la etapa de analizar una muestra biológica de dicho sujeto:

(i) detectando la presencia de una mutación en el gen del miembro 2 de la familia de proteínas Ten Eleven Translocation (TET2) que codifica el polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n°:2, en el que dicha mutación se selecciona de entre el grupo que consiste en supresiones, inserciones y mutaciones de punto, tales como mutaciones que afectan a sitios de corte y empalme, mutación de aminoácido y mutaciones Analizadoras, y/o

(ii) analizando la expresión del gen TET2;

en el que la detección de tal mutación de TET2, de la ausencia de expresión de TET2, o de la expresión de una TET2 truncada es indicativa de un sujeto que desarrolla o está predispuesto a desarrollar un tumor mieloide o un tumor linfoide.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho tumor que se debe diagnosticar es un tumor mieloide seleccionado en el grupo que comprende síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia mieloide aguda (AML), enfermedad mieloproliferativa (MPD) y síndrome mielodisplásico/mieloproliferativo, preferentemente un síndrome mielodisplásico/mieloproliferativo y más preferentemente dicho síndrome mielodisplásico/mieloproliferativo es una leucemia mielomonocítica crónica (CMML).

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho tumor que se debe diagnosticar es un tumor linfoide seleccionado en el grupo que consiste en linfoma, preferentemente linfoma de linfocitos T.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para diagnosticar una mielofibrosis (MF) en un sujeto, en el que dicho sujeto sufre policitemia vera (PV) o trombocitemia (ET), y en el que la detección de una mutación de TET2 o la subexpresión de TET2 es indicativa de un sujeto que desarrolla o está predispuesto a desarrollar una mielofibrosis (MF).

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho sujeto sufre síndrome mielodisplásico (MDS), y la detección de una mutación de TET2 o la subexpresión de TET2 es indicativa de un sujeto con un buen pronóstico.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha mutación se detecta en uno o en ambos alelos del gen TET2 que codifica el polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n°:2.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha mutación se selecciona en el grupo que consiste en una supresión o inserción y da como resultado la ausencia de expresión de la proteína TET2 o la expresión de una proteína TET2 truncada.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha proteína TET2 truncada no comprende por lo menos una de las dos regiones muy conservadas compartidas por las otras proteínas TET y que corresponde a i) la región de 31 aminoácidos situada próxima al centro de la proteína TET2 (aminoácidos 1134 a aminoácido 1444, SEC ID n°:3), o ii) la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4), preferentemente la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4).

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicha supresión o inserción se selecciona en el grupo de supresión o inserción presentado en la tabla I, que se refiere a SEC ID n°:39 para la posición de ácido nucleico y a SEC ID n°:2 para la posición de aminoácido.

Tabla I

1. Método según la reivindicación 7, en el que dicha mutación de aminoácido está situada en el marco de lectura abierto de la proteína TET2, preferentemente en por lo menos una de las dos regiones muy conservadas compartidas por las proteínas TET y que corresponde a i) la región de 31 aminoácidos situada próxima al centro de

la proteína TET2 (aminoácidos 1134 a aminoácido 1444, SEC ID n°:3), e ii) la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4), más preferentemente en la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4), y todavía más preferentemente dicha mutación de aminoácido se selecciona en el grupo que comprende o que 1 consiste en I1175V, L1197N, H1219Y, E1235V, C1271W, K1299E, L134P, R132G, G137E, A1344E, N1387S, V1417F, H1868R, G1869W, L1872P, I1873T, R1896M, y S1898F.

11. Método según la reivindicación 7, en el que dicha mutación finalizadora está situada en el marco de lectura abierto de la proteína TET2, preferentemente antes o dentro de por lo menos una de las dos regiones muy

conservadas compartidas por las proteínas TET y que corresponde a i) la región de 31 aminoácidos situada próxima al centro de la proteína TET2 (aminoácidos 1134 a aminoácido 1444, SEC ID n°:3), e ii) la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4), más preferentemente antes o dentro de la región de 8 aminoácidos

situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4), y todavía más preferentemente dicha mutación Analizadora se selecciona en el grupo que comprende o que consiste en Q232Stop, Q321Stop, S354Stop, Q417Stop, R544Stop, R55Stop, Q557Stop, Q574Stop, Q635Stop, Q642Stop, Q685Stop, L699Stop, S792Stop, Q891Stop, Q943Stop, E126Stop 5 R167Stop, R1216Stop, Y1225Stop, R144Stop, L1457Stop, R1465Stop, R1516Stop, Q1524Stop, Q1542Stop, N1624Stop, Y1724Stop, Y1751Stop, L1819Stop, y Q1834Stop.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha mutación en el gen TET2 induce una ausencia de expresión o una subexpresión del polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n°:2, preferentemente

la ausencia de expresión o subexpresión de por lo menos una de las dos regiones muy conservadas compartidas por las proteínas TET y que corresponde a i) la región de 31 aminoácidos próxima al centro de la proteína TET2 (aminoácidos 1134 a aminoácido 1444, SEC ID n°:3), e ii) la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4), más preferentemente de la región de 8 aminoácidos situada próxima al extremo carboxi terminal de la proteína 15 TET2 (que corresponde al aminoácido 1843 hasta el aminoácido 1922, SEC ID n°:4).

13. Utilización de un kit para diagnosticar in vitro un cáncer mieloide o un cáncer linfoide en un sujeto, en la que dicho kit comprende por lo menos una sonda de ácido nucleico u oligonucleótido o por lo menos un anticuerpo, que se puede utilizar en un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para detectar la

presencia de una mutación en el gen TET2 y/o analizar la expresión del gen TET2.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que dicho oligonucleótido es por lo menos un cebador de PCR, preferentemente un conjunto de cebadores de PCR, que permite amplificar una región del gen TET2.