SC1 de Trichoderma atroviride para el biocontrol de enfermedades fúngicas en plantas.

Una cepa aislada de SC1 de Trichoderma atroviride, CBS nº 122089, como agente de biocontrol.

SC1 de Trichoderma atroviride para el biocontrol de enfermedades fúngicas en plantas

Campo de la invención [0001] El campo de la presente invención es el control biológico de enfermedades de las plantas producidas por hongos patógenos por un agente de biocontrol, representado por una novedosa cepa de Trichoderma atroviride.

Antecedentes de la invención [0002] Se ha conseguido la sustitución o reducción de fungicidas químicos mediante el uso de fungicidas en base biológica, un enfoque que se encuentra dentro de la definición de control biológico como se ha propuesto por Cook y Baker (1983) : “Control biológico es la reducción de la cantidad de inóculo o actividad producida por la enfermedad

de un patógeno realizado por o mediante uno o más organismos distintos del hombre”. Esta amplia definición incluye el uso de variantes menos virulentas del patógeno, cultivares más resistentes del huésped y antagonistas microbianos “que interfieren con la supervivencia o actividades productoras de enfermedad del patógeno”.

Se requiere una evaluación más compleja de las interacciones medioambientales para usar tales agentes de biocontrol (ABC) . De hecho, las condiciones medioambientales afectan no solo a la supervivencia de los ABC, sino también a su eficacia contra los patógenos (Paulitz, 2000) . Los ABC que son más flexibles en términos de adaptación medioambiental pueden desarrollarse más fácilmente en productos comerciales, ya que sus aplicaciones y mercados diana pueden ser más amplios que aquellos de ABC que requieren condiciones medioambientales específicas.

La selección de cepas antagonistas de Trichoderma con tolerancia potenciada a condiciones medioambientales desfavorables puede aumentar la fiabilidad de los programas de biocontrol basados en Trichoderma (Kredics y col., 2000) . También es importante observar que los ABC más eficaces para su uso contra patógenos de las plantas son aquellos que tienen mejor tolerancia al estrés que los patógenos diana (Kredics y col., 2000; 2004) .

Trichoderma es un género cosmopolita, que puede colonizar tierras, rizoesferas y filoesferas. Las especies de Trichoderma se encuentran frecuentemente en madera en descomposición y material vegetal. Varias cepas de Trichoderma son productores económicamente importantes de enzimas industriales.

Ya se han usado cepas de Trichoderma como agentes de biocontrol contra numerosos patógenos de las plantas y se han desarrollado algunos para su uso como productos de biocontrol comercial (es decir, Trichoderma harzianum, conocido como Trichodex®) para cultivos de campo y de invernadero (Elad, 2000; Harman, 2000) .

Sin embargo, existe una gran variabilidad en términos de actividad de biocontrol, especificidad, mecanismo de acción, producción de metabolitos y supervivencia en tierra o sobre la planta entre especies de Trichoderma, que afectan su uso como ABC (Benitez y col., 2004) . Además, todavía hay varias patologías importantes, tales como aquellas producidas por el género Armillaria sobre la vid para las que ni se han aislado ni caracterizado agentes de biocontrol completamente eficaces.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Crecimiento radial de SC1 de Trichoderma atroviride a diferentes temperaturas. Se cultivó SC1 de Trichoderma atroviride sobre agar de dextrosa de patata (PDA) y se incubó a diferentes temperaturas: 10 (◊) , 15 (●) , 20 (■) , 25 (º) y 30 º C (×) . No se observó crecimiento a -1, 5, 37 ó 40 º C. Los puntos de datos son medias de diez duplicados. Los valores seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (P ≤ 0, 05) según la prueba de Tukey. El periodo antes del inicio del crecimiento (periodo de latencia) fue 1 día a 20,

25y30º C, 2díasa15º Cy3díasa10º C. Figura 2. Efecto del pH en el crecimiento radial de SC1 de Trichoderma atroviride. El crecimiento se llevó a cabo sobre agar de dextrosa de patata (PDA) a diferentes niveles de pH. pH 3 (º) , 4 (□) , 5 (▲) , 6 (+) , 7 (●) , 8 (◊) , 9 (x) y 10 (■) . Los puntos de datos son medias de diez duplicados. Valores seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (P ≤ 0, 05) según la prueba de Tukey. Figura 3. Efecto de la actividad del agua sobre la tasa de crecimiento de SC1 de Trichoderma atroviride. Se cultivó SC1 de Trichoderma atroviride sobre agar de dextrosa de patata modificado con glicerol a los niveles de actividad del agua de 0, 998 (▲) , 0, 990 (■) , 0, 980 (º) , 0, 960 (×) , 0, 940 (●) y 0, 910 (○) . Los puntos de datos son medias de diez duplicados. Valores seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (P≤ 0, 05) según la prueba de Tukey. El periodo antes del inicio del crecimiento (periodo de desfase) fue 1 día a 65 0, 998, 0, 990 y 0, 980, 2 días a 0, 940 y 4 días a 0, 910. Figura 4. Amplificación múltiplex de ech42 y tga3. La amplificación se llevó a cabo usando la sonda

específica ech42 (■) y la sonda general tga3 (○) de ADN puro de SC1 de Trichoderma atroviride. Las dos curvas de dilución se solapan y tienen la misma eficiencia, coeficiente de determinación (R2) y pendiente. Figura 5. Recuperación de ADN de SC1 de Trichoderma atroviride por PCR en tiempo real. La cantidad de ácido nucleico se expresa como el número de copias del genoma haploide en un gramo de tierra inoculada con una cantidad conocida de conidios. La desviación estándar (%) se calculó a partir de seis cuantificaciones independientes.

Figura 6. Supervivencia de SC1 de Trichoderma atroviride sobre hoja de fresa evaluada como unidades formadoras de colonias (UFC) . Se inocularon hojas en el día 0 pulverizando una suspensión de conidiosagua (106 UFC·ml-1) . Los puntos de datos representan los promedios de diez duplicados. Los datos se transformaron por log (x) . Las barras de error representan las desviaciones estándar de las medias. Figura 7. Supervivencia de SC1 de Trichoderma atroviride en microcosmos de tierra estática. El hongo se aplicó a una tasa de 106 UFC·g-1 de tierra en el día 0 a tres tierras estériles (a) y no estériles (b) diferentes: Tierra 1 (●) , Tierra 2 (□) y Tierra 3 (º) , los puntos de datos representan los promedios de cinco duplicados y se transformaron por log (x) . Diferentes letras para cada día indican valores que son significativamente diferentes (P ≤ 0, 05) según la prueba de Tukey. Figura 8. Efecto de SC1 de Trichoderma atroviride sobre la gravedad de la infección por el oídio. Se inocularon artificialmente plantas de pepino (panel A) y calabacín (panel B) con conidios de Podosphaera xanthii y comparación con patrones no tratados, de azufre y dos de biocontrol (T39 de Trichoderma harzianum nombre comercial Trichodex® -y F122 de T. atroviride) . Las evaluaciones se hicieron dos semanas después de la gravedad de la puntuación de la inoculación (porcentaje de tejido de hoja infectado) . Se evaluaron cinco duplicados (plantas) por tratamiento. Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes según HSD de Tukey (P ≤0, 05) . Para la inoculación artificial, se pulverizaron aproximadamente 5 ml de una suspensión acuosa de conidios (107 conidios ml-1) sobre cada planta. Las aplicaciones diarias empezaron 12 horas después de la inoculación.

Figura 9. Eficacia de SC1 de Trichoderma atroviride sobre el crecimiento de los tres principales agentes causales de la enfermedad de Esca (Phaeomoniella chlamydospora: panel A; Phaeoacremonium aleophilum, panel B; Fomitiporia mediterranea, panel C) . La eficacia del control se calculó según la fórmula: [ (C-T) /C]x100, en la que C es el crecimiento del patógeno sin el tratamiento y T es el crecimiento con el tratamiento de SC1 de Trichoderma atroviride. La inoculación de los agentes causales de Esca y SC1 de T. atroviride se hicieron sobre agar de dextrosa de patata en placas de petri. Las gráficas representan el promedio de cinco duplicados (placas de petri) . Figura 10. Crecimiento micelar de Armillaria mellea y Armillaria gallica (agentes causales de la podredumbre de la raíz) en presencia de SC1 de Trichoderma atroviride y sin (no tratados) . El efecto del experimento de T39 de Trichoderma harzianum -Trichodex® -se presenta en el presente documento como comparación estándar. El crecimiento se expresa como promedio del diámetro de cinco duplicados cultivados sobre trozos de madera sobre PDA sobre placas de petri a 20 º C. Figura 11. Porcentaje de plantas de fresa infectadas por Armillaria mellea y A. gallica (muertas) después del tratamiento de la tierra. Se comparó el efecto de SC1 de Trichoderma atroviride con el efecto sin tratar. Se usó T39 de Trichoderma harzianum -Trichodex®... [Seguir leyendo]

1. Una cepa aislada de SC1 de Trichoderma atroviride, CBS nº 122089, como agente de biocontrol.

2. La Trichoderma según la reivindicación 1 para el tratamiento de enfermedades fúngicas de las plantas.

3. Una composición agrícola que comprende la SC1 de Trichoderma atroviride aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 como principio activo.

4. La composición según la reivindicación 3 que comprende una cantidad eficaz de 102 -103 conidios ml-1 o g -1 .

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3-4 que comprende además un segundo agente de biocontrol y/o un aditivo, un emulsionante, un nutriente para las plantas, un agente de humectación, un micronutriente de las plantas o un sustrato.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en la que el sustrato se selecciona del grupo que consiste en: un medio de cultivo nutritivo, un cereal o un derivado de los mismos, un abono, un vegetal o una parte del mismo, turba, madera o un trozo de la misma, arcilla o cortezas.

7. Un procedimiento de preparación de una composición agrícola que comprende una inoculación de SC1 de Trichoderma atroviride aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en o sobre un sustrato y que permite que crezca a una temperatura comprendida de 1-30 º C hasta que se obtienen varios conidios de al meno.

10. 103

ml-1 -1

og .

8. Un procedimiento de preparación de una composición agrícola según la reivindicación 7 que comprende además una etapa de liofilización.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho sustrato se selecciona del grupo que consiste en: un medio de cultivo nutritivo, un cereal o un derivado del mismo, un vegetal o una parte del mismo, madera o un trozo de la misma, un abono, turba, arcilla o corteza.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho medio de cultivo nutritivo comprende al menos una fuente de carbono y una de nitrógeno.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en manosa, galactosa, sacarosa, extracto de malta, celobiosa, glucosa y trehalosa.

12. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha fuente de nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en: extracto de levadura, nitrito, triptona, peptona, glutamina y asparagina.

13. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho cereal es arroz o trigo.

14. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho sustrato se trata con un medio de cultivo nutritivo

antes del inóculo de SC1 de Trichoderma atroviride. 45

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho medio de cultivo nutritivo se pulveriza sobre el sustrato.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho sustrato pulverizado es corteza.

17. Un procedimiento de protección de una planta de la enfermedad producida por un hongo patógeno de las plantas caracterizado por tratar al menos una parte de la planta o la tierra dentro de la proximidad de dicha planta con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha parte de una planta es una hoja, un fruto, una semilla, una herida.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, caracterizado porque la composición se prepara según la reivindicación 6.

20. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que dicho hongo patógeno se selecciona del grupo que consiste en aquellos que causan enfermedades de la madera (Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum y Fomitiporia mediterranea) , enfermedades foliares (el agente causante del oídio Podosphaera xanthii) , enfermedades de las frutas y las flores (Botr y tis cinerea) y enfermedades

de la raíz producidas por el género Armillaria (Armillaria mellea y A. gallica) .

21. El procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en: Cucurbitaceae, Rosaceae, Vitaceae, Crucifereae, Compositae, Umbelliferae Solanaceae y Liliaceae.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en: 5 Cucurbitaceae, Rosaceae o Vitaceae.

23. Un liofilizado o un cultivo en agar de SC1 de Trichoderma atroviride según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

24. Un sustrato que comprende una cantidad eficaz del microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 12, o tratado con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5.

25. El sustrato según la reivindicación 24 obtenible según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6-15. 15

26. El sustrato según una cualquiera de las reivindicacione.

2. 25, que es corteza.

27. Un procedimiento para la detección específica de SC1 de Trichoderma atroviride, en el que la amplificación en paralelo del gen endoquitinasa 42 (ech42) , nº de acceso GenBank AB041753.1 (SEC ID Nº : 7) , y de un gen de la

subunidad α de la proteína G (tga3) , nº de acceso GenBank AF452097.1 (SEC ID Nº : 8) , se logra por PCR con conjuntos de cebadores adecuados y, en el que en una muestra que comprende dicha SC1 de Trichoderma atroviride se identifican específicamente dos nucleótidos polimórficos en la posición 185 y 196 del gen endoquitinasa 42.

28. Un procedimiento según la reivindicación 27, en el que el conjunto de cebadores para la amplificación del gen de endoquitinasa 42 (ech42) tiene la secuencia SEC ID Nº : 1 y SEC ID Nº : 2 y en el que el conjunto de cebadores para la amplificación del gen de la subunidad α de la proteína G (tga3) tiene la secuencia SEC ID Nº : 4 y SEC ID Nº : 5.

29. Un procedimiento según la reivindicación 28 que es una PCR en tiempo real y, en el que la sonda para la (ech42) comprende los nucleótidos polimórficos en la posición 185 y 196 del gen de endoquitinasa 42, preferentemente correspondiente a SEC ID Nº : 3.