Acondicionamiento de biomasa para crecimiento microbiano.

Un método para acondicionamiento de una biomasa lignocelulósica para uso como material de alimentación para un microorganismo de producción que produce una proteína deseada,

comprendiendo dicho método proporcionar una composición que comprende una biomasa lignocelulósica, poner en contacto dicha composición con una enzima oxidante de los fenoles durante un periodo de tiempo suficiente para acondicionar dicha composición, en donde la tasa de crecimiento de dicho microorganismo de producción cultivado en dicha composición acondicionada se incrementa con relación a la de una composición que comprende una biomasa lignocelulósica que no se puso en contacto con dicha enzima, y en donde dicha biomasa lignocelulósica comprende biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento ácido.

Acondicionamiento de biomasa para crecimiento microbiano

2. INTRODUCCIÓN

La invención se refiere a un método para mejorar el rendimiento de procesos microbianos que utilizan biomasa lignocelulósica como fuentes de nutrientes.

3. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos años, se han logrado avances considerables en la conversión de biomasa en etanol como combustible. La mayor parte del etanol producido a partir de biomasa hasta ahora está basada en la fermentación de glucosa de maíz en los Estados Unidos y sacarosa de caña de azúcar en Brasil. La biomasa, que está constituida en gran parte por celulosa, hemicelulosa y lignina ha atraído una adición creciente como fuente importante de energía renovable. Los residuos de silvicultura y agricultura son abundantes y relativamente económicos. Si este material, o al menos una parte importante del mismo, pudiera convertirse en combustible líquido, esto podría constituir una contribución importante a la resolución del problema del reciclamiento y la conservación de los recursos.

Puede producirse etanol a partir de materiales lignocelulósicos, tales como madera y residuos de cosechas. Los componentes de celulosa y hemicelulosa de la lignocelulosa pueden hidrolizarse para liberar monosacáridos que se fermentan luego a etanol. No obstante, ha sido difícil desarrollar un proceso económicamente viable de conversión del material celulósico en azúcares fermentables. La investigación en el uso de biomasa lignocelulósica para fabricar etanol y otros productos ha sido revisada extensamente, véase por ejemplo Lin y Tanaka (26 Appl. MIcroblol. Biotechnol. 69:627-642) y Saha (23, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3:279-291).

La lignocelulosa es un sustrato más complejo que el almidón y los azúcares. Una de las tareas limitantes de la velocidad y difíciles es la separación de la lignina. Además, los tejidos vegetales difieren enormemente con respecto a tamaño y organización. Algunos tipos de células vegetales tienen paredes celulares gruesas y una lámina media fuertemente lignificada que separa una células de otras. Estas paredes celulares tienen que ser atacadas desde la superficie luminal hacia fuera a través de la pared secundaria (en oposición a las partículas de celulosa pura, que se degradan desde el exterior hacia dentro). Además, las limitaciones impuestas por la estructura de la celulosa propiamente dicha, limitaciones adicionales son Impuestas por la difusión y el transporte del agente celulolítlco al sitio de ataque. Así, antes de la hidrólisis de la celulosa, la mayoría de los materiales leñosos se someten a un pretratamiento para hacer las fibras de celulosa contenidas en el Interior de las estructuras más sensibles y accesibles a la hidrólisis.

Se ha observado que la fermentación de los hldrolizados derivados de la madera a etanol se ve dificultada por la presencia de sustancias inhibidoras, tales como furanos, ácidos orgánicos y diversos compuestos fenólicos. Tales compuestos inhibidores se forman o se liberan durante la degradación de la lignina y hidrólisis de polisacáridos complejos existentes en la madera. La clase de compuestos tóxicos y su concentración en los hidrolizados de lignocelulosa dependen tanto de la materia prima como de las condiciones de operación empleadas para la hidrólisis. Tales compuestos tóxicos pueden reducir significativamente la utilización eficiente de los azúcares y la producción de etanol.

Cierto número de métodos de destoxificación biológicos, físicos y químicos han sido testados con hldrolizados de biomasa de pícea (Larsson et al., 1999, Appl. Biochem. Biotechnol. 77-79, 99-13). U.S. 7.67.33 da a conocer el uso del hongo Coniochaeta ligniaria para destruir los furanos contenidos en los hidrolizados. Un método utilizado corrientemente, conocido como "sobreencalado" implica el ajuste del pH inicialmente a 1-11 con un álcali, v.g. hidróxido de calcio o amoníaco y luego a 5,-6, con un ácido, v.g. ácido sulfúrico o fosfórico. Las condiciones utilizadas para la destoxificación con álcali tienen que controlarse cuidadosamente a fin de optimizar los efectos positivos y minimizar la degradación de los azúcares fermentables. Los mecanismos que subyacen tras el efecto de destoxificación con álcali y la influencia de la elección del catión y las condiciones no son bien conocidos. (Nilvebrant et al. 23, Appl. Biochem. Biotechnol. 15 -18:615-28; Persson et al., 22, J Agrie Food Chem. 5(19):5318-25). Si bien el sobreencalado es muy eficaz, conduce a un precipitado insoluble que persiste a través de los pasos subsiguientes y tiene que eliminarse y desecharse, dando como resultado desechos y coste incrementado.

La eficacia de un método de destoxificación es variable debido que cada tipo de hldrollzado tiene un grado de toxicidad diferente, y cada especie o incluso cada cepa de microorganismo tiene un grado diferente de tolerancia a los inhibidores. Por tanto, los diferentes métodos de destoxificación no pueden compararse estrictamente cuando se utilizan hidrolizados de fuentes distintas y microorganismos diferentes. (Mussatto y Roberto, 24, Bioresour. Technol. 93( 1): 1 -1; Palmqvist y Hahn-Hagerdal, 2, Bioresour. Technol. 74:25-33; Palmqvist y Hahn- Hagerdal, 2, Bioresour. Technol. 74:17-24).

Larsson et al., 1999, Appl. Biochem. Biotechnol. 77-79: 91-13 da a conocer métodos para destoxificación de

biomasa lignocelulósica tratada con ácidos con fenoloxidasa, lacasa y Tríchoderma reesei para la producción de etanol.

Bigelow et al., 22, Appl. Biochem. Biotechnol. 98-1: 921-34 da a conocer la producción de celulosa por Tríchoderma reesei en bagazo pretratado con agua callente.

SI bien el foco de gran parte de la Investigaciones está dirigido a la destoxificaclón de hidrolizados de madera para fermentación etanóllca, el uso de biomasa lignocelulósica como material de alimentación para otros procesos blotecnológlcos está relativamente Inexplorado. Por ejemplo, debido a la creciente demanda de enzimas celulasa en una diversidad de Industrias, existe claramente necesidad de nuevos métodos para aumentar la producción de celulasas a partir de hongos, v.g., Tríchoderma reesei a fin de que las enzimas celulasa puedan ser disponibles de modo más económico.

Incluso dentro del contexto de la generación de etanol, existe una necesidad urgente de mejora en la economía y eficiencia de los diversos enfoques diferentes en la conversión de lignocelulosa en azúcares para etanol.

4. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente Invención se refiere a métodos para mejorar el rendimiento de procesos microbianos que utiliza biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamlento ácido como fuente de nutrientes. En particular, la Invención proporciona métodos, como se definen en las reivindicaciones, para preparación de una composición que comprende biomasa lignocelulósica que está acondicionada para crecimiento microbiano. Una composición de este tipo puede utilizarse como componente en un material de alimentación para un proceso microbiano. Los métodos comprenden poner en contacto una composición que comprende biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento ácido con una composición enzimática que comprende una enzima oxidante de los fenoles durante un periodo de tiempo suficiente para neutralizar los compuestos inhibidores presentes en la composición. La composición acondicionada puede soportar una tasa de crecimiento de una especie de microorganismo de producción que es mayor que la que puede obtenerse con una composición de biomasa lignocelulósica que no se había puesto en contacto con la composición enzimática. En una realización, la composición enzimática comprende una lacasa. En una realización, la biomasa lignocelulósica se deriva de plantas no leñosas, tales como maíz y/o caña de azúcar. En una realización, la composición enzimática comprende una lacasa y la biomasa lignocelulósica se selecciona de forraje de maíz y bagazo de caña de azúcar.

La invención abarca también métodos como se definen en las reivindicaciones, para cultivo de microorganismos que son sensibles a ciertos compuestos inhibidores presentes en la biomasa lignocelulósica. En una realización, una composición que comprende una biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento ácido se pone en contacto con una composición enzimática que comprende una enzima oxidante de los fenoles durante un periodo de tiempo suficiente para acondicionar la composición para crecimiento microbiano. La composición acondicionada se utiliza luego como un componente de la alimentación para cultivar los microorganismos. Alternativamente, la composición enzimática se añade directamente a un proceso... [Seguir leyendo]

1. Un método para acondicionamiento de una biomasa lignocelulósica para uso como material de alimentación para un microorganismo de producción que produce una proteína deseada, comprendiendo dicho método proporcionar una composición que comprende una biomasa lignocelulósica, poner en contacto dicha composición 5 con una enzima oxidante de los fenoles durante un periodo de tiempo suficiente para acondicionar dicha composición, en donde la tasa de crecimiento de dicho microorganismo de producción cultivado en dicha composición acondicionada se incrementa con relación a la de una composición que comprende una biomasa lignocelulósica que no se puso en contacto con dicha enzima, y en donde dicha biomasa lignocelulósica comprende biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento ácido. 10

2. Un método para cultivo de un microorganismo de producción que produce una proteína deseada, comprendiendo dicho método poner en contacto una composición que comprende una biomasa lignocelulósica con una enzima oxidante de los fenoles durante un periodo de tiempo suficiente para acondicionar dicha composición para crecimiento microbiano, y dejar crecer dichos microorganismos en dicha composición acondicionada, en donde 15 la tasa de dicho microorganismo cultivado en dicha composición acondicionada se incrementa con relación a la de una composición que comprende biomasa lignocelulósica que no se puso en contacto con dicha enzima, y en donde dicha biomasa lignocelulósica comprende biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento ácido.

3. Un método para producción de una proteína deseada, comprendiendo dicho método cultivar un 20 microorganismo que produce dicha proteína en una composición que comprende una biomasa lignocelulósica que está acondicionada para crecimiento microbiano, en donde dicha composición acondicionada se ha puesto en contacto con una enzima oxidante de los fenoles durante un periodo de tiempo suficiente para acondicionar dicha composición, y en donde la tasa de crecimiento de dichos microorganismos cultivados en dicha composición acondicionada se incrementa con relación a la de una composición que comprende biomasa lignocelulósica que no 25 ha sido puesta en contacto por dicha enzima, y en donde dicha biomasa lignocelulósica comprende biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento ácido.

4. El método de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde dicha biomasa lignocelulósica comprende biomasa lignocelulósica que no ha sido sometida a pretratamiento con álcali. 30

5. El método de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde dicha biomasa lignocelulósica comprende biomasa lignocelulósica no leñosa.

6. El método de la reivindicación 6, en donde dicha biomasa lignocelulósica no leñosa se selecciona de la lista 35 constituida por paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, bagazo de caña de azúcar, forraje de maíz, tallos de maíz, carozos de maíz, vainas de maíz, pulpa de remolacha azucarera, hierbas de pradera, hierba de tallo azul grande, hierba de tallo azul pequeña, hierba índica, mijo perenne, hierba gama, y carricera.

7. El método de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde dicha enzima oxidante de los fenoles se selecciona de la lista constituida por una lacasa, una bilirrubina-oxidasa, una fenol-oxidasa, y una catecol-oxidasa.

8. El método de la reivindicación 8, en donde dicha enzima oxidante de los fenoles es una lacasa producida en una especie de Stachybotr y s o una especie de Trichoderma. 45

9. El método de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde dicho microorganismo es una especie de Trichoderma.

10. El método de la reivindicación 3, en donde el método comprende adicionalmente recuperar la proteína deseada de dichos microorganismos y/o dicha composición acondicionada. 50

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 11, en donde dicha proteína deseada es una enzima.

12. El método de la reivindicación 12, en donde dicha enzima es una celulasa. 55

13. El método de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde dicha biomasa lignocelulósica es forraje de maíz que no ha sido pretratado con ácido, dicha enzima oxidante de los fenoles comprende una lacasa producida por una primera especie de Trichoderma o una especie de Stachybotr y s, y dicho microorganismo cultivado en dicha composición es una segunda especie de Trichoderma. 60

14. El método de la reivindicación 14, en donde dicha primera especie de Trichoderma es Trichoderma piluliferum, dicha segunda especie de Trichoderma es Trichoderma reesei, y dicha proteína deseada es una celulasa.