Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas.

Una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora,

presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de aminoácidos con al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos: **Fórmula**

presentando dicha variante únicamente una, dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución L417V, L417A, L417D, L417E, L417F, L417G, L4171, L417K, L417Q, L417R, L417S, L417T, L417W o L417Y en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12164776.

Solicitante: DANISCO US INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 925 PAGE MILL ROAD PALO ALTO, CA 94304 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: AEHLE, WOLFGANG, BOTT, RICHARD, R., NIKOLAEV,IGOR, SCHEFFERS,Martijn, VAN SOLINGEN,PIET, VROEMEN,CASPER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/37 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de hongos.
  • C12N15/31 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12N15/56 C12N 15/00 […] › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N9/24 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
  • C12N9/34 C12N 9/00 […] › Glucoamilasa.
  • C12R1/885 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Trichoderma.

PDF original: ES-2516265_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a variantes de una glucoamilasa precursora que presentan propiedades modificadas (p. ej., termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas) . En concreto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden las glucoamilasas variantes, entre las que se incluyen composiciones hidrolizantes de almidón, composiciones de pienso animal y composiciones de limpieza. La invención también hace referencia a construcciones de ADN que codifican las variantes y a métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las enzimas de glucoamilasa (glucano 1, 4-α-glucohidrolasas, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas hidrolizantes de almidón que actúan en exo, que catalizan la eliminación de unidades de glucosa sucesivas de los extremos no reductores de moléculas relacionadas con oligosacáridos o polisacáridos o almidón. Las glucoamilasas pueden hidrolizar tanto los enlaces glucosídicos lineales como ramificados de almidón (p.ej.,

amilosa y amilopectina) .

Las glucoamilasas se producen mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Especialmente interesantes, y comercialmente importantes, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen de forma extracelular, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun. 48:529-544; Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 -1102; Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. 20 Chem. 53:923 -929; patente estadounidense 5.024.941; patente estadounidense 4.794.175 y WO 88/09795) ; Talaromyces (patente estadounidense 4.247.637; patente estadounidense 6.255.084 y patente estadounidense 6.620.924) ; Rhizopus (Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957 -964; Ashikari et al., (1989) App. Microbiol. and Biotech. 32:129 -133 y patente estadounidense 4.863.864) ; Humicola (WO 05/052148 y patente estadounidense 4.618.579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:210 -217) .

Muchos de los genes que codifican estas enzimas han sido clonados y expresados en células bacterianas, fúngicas y/o levadura.

Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p. ej., para la producción de glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón) . Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz con alto 30 contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse, y normalmente se utilizan, con alfa-amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar almidón en dextrinas y posteriormente glucosa. La glucosa puede entonces convertirse en fructosa por parte de otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa) ; cristalizada; o utilizada en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol y 1, 3-propanodiol) . El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de almidón y/o material que contiene celulosa puede utilizarse como una fuente de combustible o para consumo alcohólico.

WO 2006/060062 expone la glucoamilasa Trichoderma reesei TrGA y los usos en conversión de almidón, pienso animal y fermentación de alcohol.

Aunque las glucoamilasas se han utilizado con éxito en aplicaciones comerciales durante muchos años, todavía existe la necesidad de nuevas glucoamilasas con propiedades modificadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona variantes de glucoamilasa que son variantes de una glucoamilasa precursora, en la que las que la glucoamilasa precursora presenta una secuencia de aminoácidos con al menos 45 un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:

y las variantes presentan solo una, dos, tres o cuatro sustituciones comparadas con la glucoamilasa precursora, en las que las sustituciones comprenden la sustitución L417V, L417A, L417D, L417E, L417F, L417G, L417I, L417K, L417Q, L417R, L417S, L417T, L417W o L417Y en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en la glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa son variantes de una glucoamilasa precursora que presenta al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan únicamente dos, tres o cuatro sustituciones comparadas con la glucoamilasa precursora, en las que las sustituciones adicionales se eligen de 10 entre sustituciones correspondientes a la posición 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61, 67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263. 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 418, 430, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en la glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan actividad específica aumentada comparadas con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2. En algunas formas de realización, la variante de glucoamilasa de la reivindicación 1, en la que las variantes presentan termoestabilidad aumentada comparadas con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2. En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada comparadas con la glucoamilasa que comprende SEQ ID NO:2.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa son variantes de una glucoamilasa precursora obtenida a partir de una Trichoderma spp.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican variantes de glucoamilasa como 25 se define en la reivindicación 1.

También se proporcionan células huésped que comprenden polinucleótidos de la invención.

La presente invención también proporciona composiciones de enzima que comprenden variantes de glucoamilasa como se define en la reivindicación 1.

En algunas formas de realización, las composiciones de enzima son adecuadas para utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una composición de pienso animal o un proceso de fermentación de sustrato con almidón. En algunas formas de realización, las composiciones de enzima comprenden además un alfa amilasa.

La presente invención también proporciona métodos para producir glucoamilasas variantes en una célula huésped que comprenden: la transformación de células huésped con construcciones de ADN que comprenden polinucleótidos de la invención y el cultivo de células huésped en las condiciones adecuadas para la expresión y producción de variantes de glucoamilasa y la producción de variantes.

En algunas formas de realización, los métodos comprenden además la recuperación de las variantes de glucoamilasa del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La fig. 1A ilustra una glucoamilasa Trichoderma reesei (TrGA) que presenta 632 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) El péptido señal se subraya, la región catalítica (SEQ ID NO:3) que comienza con los residuos de aminoácidos SVDDFI (SEQ ID NO:12) y que presenta 453 residuos de aminoácidos está en negrita; la región de enlace está en cursiva y el dominio de unión a almidón (SBD) está tanto en cursiva como subrayado. La proteína madura que incluye el dominio catalítico (SEQ ID NO:3) , la región de enlace (SEQ ID NO:10) y el

dominio de unión a almidón (SEQ ID NO:11) se representan mediante SEQ ID NO:2. La fig. 1B ilustra el ADNc (SEQ ID NO:4) que codifica la TrGA. La fig. 1C ilustra los dominios de TrGA de proteína madura y precursora. La fig. 2 ilustra el plásmido de destino pDONR-TrGA que incluye el ADNc (SEQ ID NO:4) de la TrGA. La fig. 3 ilustra el plásmido pTTT-Dest.

La fig. 4 ilustra el vector de expresión final pTTT-TrGA. Las figs. 5A-5B ilustran una comparación de alineación de los dominios catalíticos de las glucoamilasas precursoras que incluyen glucoamilasa derivada de Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO:5) ; Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO:6) ; Aspergillus or y zae (AoGA) (SEQ... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una variante de glucoamilasa, que es una variante de una glucoamilasa precursora, presentando dicha glucoamilasa precursora una secuencia de aminoácidos con al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos:

presentando dicha variante únicamente una, dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, en la que dichas sustituciones comprenden la sustitución L417V, L417A, L417D, L417E, L417F, L417G, L4171, L417K, L417Q, L417R, L417S, L417T, L417W o L417Y en SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

2. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha glucoamilasa precursora presenta al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.

3. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha variante presenta únicamente dos, tres o cuatro sustituciones en comparación con dicha precursora, sustituciones adicionales que se eligen de sustituciones en una posición correspondiente a la posición 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61,

67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263. 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 418, 430, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

4. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

5. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

6. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la variante presenta actividad específica aumentada y termoestabilidad aumentada en comparación con la glucoamilasa que comprende SEQ ID NO:2.

7. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa precursora se obtiene a partir de una Trichoderma spp.

8. Un polinucleótido que codifica la variante de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la composición es adecuada para

utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una composición de pienso animal o un proceso de 35 fermentación de sustrato que contiene almidón.

12. Composición de enzima de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además un alfa-amilasa.

13. Un método para producir una glucoamilasa variante en una célula huésped que comprende:

la transformación de una célula huésped con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 y el cultivo de la célula huésped con las condiciones adecuadas para la expresión y producción de dicha variante de glucoamilasa y la producción de dicha variante.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa de dicho cultivo.

Dibujos


 

Patentes similares o relacionadas:

Cadena ligera de enteroquinasa modificada, del 22 de Julio de 2020, de NOVO NORDISK A/S: Un análogo de la cadena ligera de la enteroquinasa bovina que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho análogo comprende […]

Detección de interacciones proteína a proteína, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Un método para medir cuantitativamente la fuerza y la afinidad de una interacción entre una primera proteína de membrana o parte de la misma y una […]

Métodos y composiciones para ingeniería genómica, del 3 de Junio de 2020, de Sangamo Therapeutics, Inc: Una pareja de nucleasas de dedo de zinc (ZFN) que comprende una ZFN izquierda y una ZFN derecha, comprendiendo cada ZFN un dominio de escisión […]

Métodos y composiciones para escisión dirigida y recombinación, del 20 de Mayo de 2020, de Sangamo Therapeutics, Inc: Un método in vitro para la escisión selectiva de un gen HLA clase I, un gen HLA que codifica una proteína de clase 1 del Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC) […]

Antígenos de coagulasa estafilocócica y métodos para su uso, del 13 de Mayo de 2020, de UNIVERSITY OF CHICAGO: Una composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, en donde cada uno de los al menos dos dominios […]

Reconocimiento de unión a diana celular mediante un agente bioactivo usando transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia intracelular, del 6 de Mayo de 2020, de PROMEGA CORPORATION: Un sistema de ensayo que comprende: (a) una biblioteca de agentes bioactivos, cada uno de los cuales está fijado a un fluoróforo; (b) una diana celular fusionada a […]

Etiqueta de epítopo y método de detección, captura y/o purificación de polipéptidos etiquetados, del 15 de Abril de 2020, de ChromoTek GmbH: Péptido epítopo aislado que tiene de 12 a 25 aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia según se define en SEQ ID NO: 32 (X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12), […]

Utilización diagnóstica de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y un enzima MGMT, del 15 de Abril de 2020, de INSTITUT PASTEUR: Utilización in vitro de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y i) el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63) o un homólogo […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .