RNasa T2 humana recombinante y usos de la misma.

Una proteína de ribonucleasa aislada de la familia T2 como se expone en SEC ID Nº:

4, en la que la actividad ribonucleasa se inactiva por calor mediante autoclave y tiene actividad de unión a actina.

RNasa T2 humana recombinante y usos de la misma La presente invención se refiere a una proteína de ribonucleasa aislada de la familia T2 como se expone en SEC ID Nº : 4 de acuerdo con la reivindicación 1, una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, y un artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 10.

La presente divulgación se refiere a una proteína de ribonucleasa T2 humana, que tiene propiedades de unión a actina y antitumorales, y la clonación y expresión de la misma en células de levadura. Además, la presente invención se refiere a métodos para el uso de proteínas de ribonucleasa T2 humanas en el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con tumores sólidos y crecimiento metastásico en un sujeto, y nuevos métodos para la purificación de ribonucleasas T2 humanas. La presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen, como un principio activo, una ribonucleasa humana de la familia T2 o un polinucleótido que la codifica para el tratamiento de enfermedades o trastornos proliferativos en general y cáncer en particular.

Existe un interés continuado, tanto dentro de la comunidad médica como entre la población general, en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos proliferativos celulares tales como cáncer.

Pueden usarse potencialmente como fármacos antineoplásicos, agentes que presentan propiedades antriproliferativas, anticolonización, antidiferenciación y/o antidesarrollo (como antiangiogénesis) contra células de mamífero. Como tales, estos agentes se buscan ampliamente de fuentes tanto naturales como sintéticas.

Las RIBASAS son ribonucleasas (RNasas) que presentan una actividad biológica que es distinta de su capacidad para degradar ARN. Se sabe que las RIBASAS y sus homólogos estructurales efectúan un gran número de reacciones celulares (Rybak, M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207; Schein, C. H. 1997 Nature Biotechnol. 15: 529-536) . Se cree que EDN y ECP, dos proteínas importantes halladas en los gránulos secretores de eosinófilos citotóxicos (miembros de la familia de RNasa A) participan en la respuesta inmunitaria. En plantas autoincompatibles las RNasas S del estilo (miembros de la familia de RNasa T2) , detienen el crecimiento del tubo polínico y de este modo evitan la fertilización. La RC-RNasa, producida a partir de oocitos de rana toro, inhibe, in vitro, el crecimiento de células tumorales tales como las líneas celulares de leucemia P388 y L1210 y es eficaz para la destrucción in vivo de células de sarcoma 180, Erlich, y líquido ascítico Mep II (Chang, C-F. et al 1988, J. Mol Biol

283: 231-244) . Algunas RNasas presentan actividad ribonucleasa limitada, un ejemplo de las cuales incluye angiogeninas que estimulan la formación de vasos sanguíneos (Fett, J. W. 1985, Biochemistr y 24: 5480-5486) .

Los organismos vivos usan RNasas extracelulares para su defensa contra patógenos y células tumorales. Por ejemplo, se secreta ECP en respuesta a un ataque de parásitos (Newton, DL. 1992, J. Biol. Chem. 267: 1957219578) y presenta actividad antibacteriana y antiviral. Esta actividad también se presenta por Cinc-α2-glicoproteína (Znα2gp) , una RNasa presente en la mayoría de los fluidos corporales humanos incluyendo sangre, plasma seminal, leche materna, líquido sinovial, saliva, orina y sudor (Lei G, et al., 1998, Arch Biochem Biophys. 15 Jul; 355 (2) : 1604) .

El mecanismo específico por el que las RNasas extracelulares actúan en reacciones celulares se desconoce.

La principal barrera para la actividad citotóxica de algunas RNasas es la membrana celular. Se ha descubierto que ECP forma canales en membranas tanto artificiales como celulares. Supuestamente, ECP liberado de la membrana granular junto con EDN (RNasa eosinófila, que es responsable de la destrucción de células de Purkinjie celebelares) transfiere EDN al espacio intercelular. La entrada de la toxina fúngica α-sarcina (un miembro de la familia de RNasa A) en células diana depende de la infección viral que permeabiliza la membrana celular (Rybak, M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207) . También es posible que las RNasas entren a la célula mediante endocitosis. Cuando los fármacos disruptores del Golgi ácido retinoico o monensina se usaron para suministrar artificialmente RNasa BS a las células, la citotoxicidad aumentó drásticamente (Wu Y, et al., 1995, J Biol Chem. 21; 270 (29) : 17476-81) .

La citotoxicidad de las RNasas puede usarse para fines terapéuticos. La RNasa L humana se activa por interferón e inhibe el crecimiento viral. La expresión del gen para RNasa L humana junto con el de una 2’5’-A sintetasa en plantas de tabaco es suficiente para proteger las plantas del virus del mosaico del pepino y para prevenir la replicación del virus de la patata Y. El virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) induce el bloqueo en las rutas antivirales de RNasa L (Schein, C. H. 1997 Nature Biotechnol. 15: 529-536.) . Las RNasas pueden fusionarse con anticuerpos de proteína de membrana específicos para crear inmunotoxinas. Por ejemplo, la fusión de RNasa A con anticuerpos para el receptor de transferrina o para el antígeno de linfocitos T CD5 conduce a la inhibición de la síntesis proteica en células tumorales que portan un receptor específico para cada una de las toxinas anteriores (Rybak, M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207; Newton DL, et al., 1998, Biochemistr y 14; 37 (15) : 517383) . Ya que las RNasas son menos tóxicas para los animales, estas pueden tener menos efectos secundarios indeseables que las inmunotoxinas usadas actualmente.

La citotoxicidad de ribonucleasas citotóxicas parece estar relacionada de forma inversa con la fuerza de la interacción entre un inhibidor de ribonucleasa (RI) y la RNasa. El inhibidor de ribonucleasa (RI) es una molécula de origen natural hallada dentro de células de vertebrados que actúa para proteger estas células de los efectos potencialmente letales de las ribonucleasas. El inhibidor de ribonucleasa es una proteína citosólica de 50 kDa que se une con RNasas con diversa afinidad. Por ejemplo, el RI se une con miembros de la superfamilia de ribonucleasa pancreática bovina A (RNasa A) de ribonucleasas con constantes de inhibición que abarcan diez órdenes de magnitud, variando las Ki de 10-6 a 10-16 M.

A-RNasas La ONCONASA, como RNasa A y RNasa BS, es un miembro de la superfamilia de RNasa A. Los miembros de la superfamilia de RNasa A comparten aproximadamente el 30 % de identidad en secuencias de aminoácidos. La mayoría de los restos no conservados se localizan en bucles superficiales y parecen desempeñar un papel significativo en la actividad biológica dedicada de cada RNasa. Se aisló ONCONASA de oocitos y embriones tempranos de la rana Leopardo (Rana pipiens) . Tiene efecto antitumoral en una diversidad de tumores sólidos, tanto in situ como in vivo (Mikulski S. M., et al., 1990 J. Natl. Cancer 17; 82 (2) : 151-3) . También se ha descubierto que la ONCONASA inhibe específicamente la replicación de VIH-1 en células de leucemia H9 infectadas a concentración no citotóxica (Youle R. J., et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 21; 91 (13) : 6012-6) .

Aunque la actividad RNasa de ONCONASA es relativamente baja, se acepta que las actividades enzimática y citotóxica de la misma están asociadas en algún grado. Se cree que la estructura terciaria de A-RNasas diferencia entre tipos citotóxicos y no citotóxicos. Por ejemplo, se cree que las diferencias entre la estructura terciaria de ONCONASA y RNasa A son responsables de la citotoxicidad aumentada observada para ONCONASA. La ONCONASA, a diferencia de RNasa A, contiene un resto Glu1 N terminal bloqueado (piroglutamato) que es esencial para las actividades tanto enzimática como citotóxica. Esta estructura única permite que la ONCONASA permee a células diana (Boix E., et al., 1996, J. Mol. Biol. 19: 257 (5) : 992-1007) . Además, en la ONCONASA el resto Lys9 reemplaza el resto Gln11 de RNasa A, que se cree que efectúa la estructura del sitio activo. Además, las diferencias en la secuencia de aminoácidos de la estructura primaria entre ONCONASA y RNasa A provocan cambios topológicos en la periferia del sitio activo que efectúan la especificidad del mismo (Mosimann S. C., et al., 1992, Proteins 14 (3) : 392-400) .

Las diferencias en toxicidad entre las A-RNasas también se atribuyen a su capacidad para unirse con RI. La ribonucleasa seminal bovina (RNasa BS) es 80 % idéntica en su secuencia de aminoácidos a RNasa A, pero a diferencia de otros miembros de la superfamilia de RNasa A, la RNasa BS existe en una forma dimérica. Se ha mostrado que la estructura cuaternaria de RNasa... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de ribonucleasa aislada de la familia T2 como se expone en SEC ID Nº : 4, en la que la actividad ribonucleasa se inactiva por calor mediante autoclave y tiene actividad de unión a actina.

2. La proteína de ribonucleasa aislada de la familia T2 de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de ribonucleasa tiene una actividad antineoplásica.

3. La proteína de ribonucleasa de la reivindicación 1 o 2 para su uso en la prevención, inhibición o inversión en un sujeto mamífero que lo necesite, de un trastorno o enfermedad asociado con células de proliferación anómala seleccionado del grupo que consiste en hiperproliferación, tumorogénesis, crecimiento tumoral, colonización y angiogénesis.

4. Una composición farmacéutica que comprende, como un principio activo, la proteína de ribonucleasa de la familia T2 de la reivindicación 1 o 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La proteína de ribonucleasa de la reivindicación 3, en la que dicho trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en papiloma, blastoglioma, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Burkitt, artritis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, angiogénesis, reestenosis, reestenosis en endoprótesis y reestenosis de injerto vascular, vitreorretinopatía proliferativa, enfermedad proliferativa inflamatoria crónica, dermatofibroma y psoriasis.

6. La proteína de ribonucleasa de la reivindicación 3 o 5, en la que dicha proteína de ribonucleasa se diseña para administrar al sujeto por un modo de administración seleccionado del grupo que consiste en administración oral, administración intravenosa, administración subcutánea, administración sistémica, administración tópica, administración transmucosa, administración parenteral, administración rectal e inhalación.

7. La proteína de ribonucleasa de la familia T2 de la reivindicación 1 o 2 para uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto que lo necesite.

8. La proteína de ribonucleasa de la reivindicación 7, en la que dicho tumor es un tumor metastásico.

9. La proteína de ribonucleasa de la reivindicación 7 u 8, diseñada para administración por un modo de administración seleccionado del grupo que consiste en administración oral, administración intravenosa, administración subcutánea, administración sistémica, administración tópica, administración transmucosa, administración parenteral, administración rectal e inhalación.

10. Un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y:

(a) la proteína de ribonucleasa de la reivindicación 1 o 2 y

(b) al menos un agente quimioterapéutico, en el que dicha proteína de ribonucleasa es capaz de potenciar adicionalmente la actividad de dicho agente quimioterapéutico de una manera sinérgica; en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta o prospecto que indica que dicha proteína de ribonucleasa o dicho polinucleótido y dicho agente quimioterapéutico son para el tratamiento de cáncer en un sujeto.